2.1 Объекты исследования
Объектом исследования в дипломной работе являлись микроорганизмы, выделенные из различных природных жиров: нерпичьего (Н), нерпичьего, выращенного на среде с шёрстным жиром (Нв), шерстного (В) и микроорганизмы, выделенные из сточных вод после проведения процесса обезжиривания (3, 8).
Для выполнения работы были использованы следующие химические материалы:
1 Нерпичий жир – жидкость от светло-желтого до темно-коричневого цвета. Получают вытапливанием, экстрагированием, прессованием и сепарированием. В кожевенном производстве используют нерпичий жир с кислотным числом не менее 25.
2 Шёрстный жир –выделяют овцы в виде жиропота в количестве его достигает 5 - 10 % от массы шерсти. Сырой шерстяной жир, выделенный из промывных вод, - густая пастообразная масса бурого цвета. В нем содержатся кроме воска свободные жирные кислоты, глицериды, белки, слизи, красящие вещества, минеральные примеси и пр. Выделенные из шерстяного жира воски с примесью некоторых высокомолекулярных соединений называют техническим ланолином. В очищенном виде этот продукт называется ланолином. Он представляет собой светло-желтое мазеобразное вещество, обладающее высокой гигроскопичностью.
3 Агар-агар – ГОСТ 16280–88 пищевой. Представляет собой порошок белого цвета без постороннего запаха, вкуса. Наличие плесени и видимых посторонних включений не допускается. Физико-химические показатели должны соответствовать требованиям, указанным в таблице 1
Таблица 1 — Физико-химические показатели агар-агара
| Наименование показателей | Показатели |
| Цвет студня с массовой долей сухого агара 0,85 %, %, не менее | 45 - 60 |
| Прочность студня с массовой долей сухого агара 0,85 %, г, не менее | 200 - 300 |
| Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0,85 %, °С, не ниже | 80 |
| Массовая доля влаги, %, не более | 18 |
| Массовая доля золы (в пересчете на сухое вещество), %, не более | 4,5 |
| Наличие йода и тяжелых металлов | Не допускается |
| Массовая доля общего азота (в пересчете на сухое вещество), %, не более | 0,2 |
4 Питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой – порошок светло - жёлтого цвета рН=7,2±0,2. Препарат гигроскопичен. Приготовление: 15 г препарата растворяется в 1 л дистилированной воды. Состав (г/л): панкреатического гидролизата кальция – 10,05; хлорида натрия – 4,95.
5 Вода дистиллированная. Предназначена для аналитических целей Н2О (ГОСТ 6709-73). Молекулярная вес 18. Концентрация водородных ионов в пределе 5,4-6,6. Сухой остаток не более 5 мг/л, после прокаливания не более 1мг/л.
6 Хлорид калия КСl, мол. масса 58,46 (ГОСТ 13380-68), добывают из недр открытым или подземным способом, получают из рапы озер или лиманов после естественного испарения воды, из морских вод сгущением растворов в специальных садочных бассейнах и выравниванием естественных рассолов на солевых заводах. Хлорид калия технический получают из отходов производства хлорида натрия. Эта соль содержит примеси хлорида магния и сульфата кальция. Применяется для приготовления синтетической среды.
7 Хлорид кальция технический (ГОСТ 450-77) получают в обезвоженном виде - CaCl2, плавленном виде – СаСl ´ 2Н2О, в жидком виде. Применяют для приготовления синтетической среды.
8 Фосфат аммония (NH4)3РO4, мол. масса 132,14 (ГОСТ 9097-74), - кристаллы белого или слабо-желтого цвета. Фосфат аммония технический (ТУ 6-03-395-75) получают из раствора фосфата аммония, являющегося отходом производства жидкого ангидрида.
Кроме того, использовались различные органические и неорганические кислоты и соли для определения культуральных свойств микроорганизмов и приготовления питательных сред.
2.2 Методы исследования
2.2.1 Методика приготовления питательных сред для культивирования микроорганизмов
Мясопептонный агар (МПА)
При культивировании микроорганизмов большое значение имеет обеспечение их соответствующим питанием. Белковой основой для всех сред является питательный бульон. Основой для приготовления мясопептонного бульона (МПБ) является мясная вода. Ее готовят следующим образом: 15 г сухого бульона растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды и кипятят 1-3 мин. Для приготовления плотной питательной среды МПА к 1 дм3 МПБ добавляют 2-2,5% агар-агара от объема среды и расплавляют в автоклаве.
Синтетическая среда Рана
В 1 дм3 дистиллированной воды растворяют соли следующего состава (г/дм3): К2HPO4-5,0; (NH4)3РO4-5,0; KCl-следы; СаCl2-1,0; MgSO4 Х 7H2O-1,0; FeCl3 Х 7H2O-следы. В качестве источника углерода используют нерпичий жир в количестве 1 г/дм3. Для приготовления плотной синтетической среды добавляют агар-агар в количестве 2-2,5% от объема жидкой среды и расплавляют в автоклаве при давлении 1атм.
2.2.2 Выделение чистой культуры методом разведений
Разведения делают в стерильной водопроводной воде. Готовят определенный объем этого раствора и стерилизуют при 1 атм. В ходе одного опыта пользуются постоянным коэффициентом разведения, т.к. в этом случае уменьшается вероятность ошибки. Чаще всего делают десятичные разведения. Для этого берут пробирку с 10 см3 стерильного раствора и переносят стерильной пипеткой 1 см3 исследуемого материала в данную пробирку. Суспензию этого разведения тщательно перемешивают с помощью новой стерильной пипетки, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную смесь несколько раз. Это обеспечивает перемешивание суспензии и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой берут 1 см3 полученного разведения и переносят его во вторую пробирку. Таким образом, готовят и последующие разведения. Степень разведения определяется предполагаемым количеством микроорганизмов в образце и соответственно число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате.
Для приготовления каждого разведения обязательно используют отдельную пипетку. Пренебрежение этим правилом может привести к получению ошибочного результата. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки при приготовлении соответствующего разведения. Часть клеток, оставшаяся на стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведений, что и явится причиной получения завышенного результата.
В стерильные чашки Петри наливают расплавленную на кипящей водяной бане агаризованную среду, по 20-30 см3 в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока не остынет агар. Для посева отбирают чашки, среда в которых осталась стерильной. Когда используют элективные среды или выделяют и учитывают микроорганизмы, требующие повышенной влажности, посев проводят сразу же или вскоре после застывания агара.
Посев делают из определенных разведений в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов в исследуемом субстрате. Стерильной пипеткой наносят определенный объем (обычно 0,05; 0,1 или 0,2 см3) соответствующего разведения, предварительно тщательно перемешанного, на поверхность агаровой пластинки в чашки Петри. Этот объем распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Затем этим же шпателем проводят по всей поверхности во второй чашке, куда посевной материале вносили. При выявлении микроорганизмов, количество которых в субстрате относительно не велико, посевной материал распределяют по поверхности среды только в одной чашке.
Из каждого исследуемого разведения делают таким образом 2 - 3 параллельных высева. Для параллельных высевов из одного разведения можно пользоваться одной пипеткой и одним шпателем. Для посевов из разных разведений используют другую стерильную пипетку и другой шпатель. Чашки с засеянными средами помещают в термостат, отрегулированный на определенную температуру, благоприятную для развития выявляемых микроорганизмов.
Подсчет выросших колоний проводят через определенное время после посева, которое зависит от скорости роста выявляемых микроорганизмов на используемой в опыте среде и данной температуре.
Подсчитывают количество колоний, выросших при высеве из определенного разведения на двух (одной) чашки Петри. Результаты параллельных высевов суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из этого разведения. Колонии считают, как правило, не открывая чашки. Для удобства отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки, пользуясь стеклографом или чернилами по стеклу. При большом количестве колоний дно чашки делят на секторы, подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результаты суммируют или используют полуавтоматические счетчики.