ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ по изменению показателей обратимой агрегации эритроцитов (ОАЭ) крови
Методические рекомендации
Методические рекомендации 13 с., 1 ч., 5 табл., 9 источников, 1 приложение
В настоящих методических рекомендациях приводится описание методики определения биологической активности торфов и сапропелей по изменению показателей обратимой агрегации эритроцитов (ОАЭ) при внесении исследуемого препарата in vitro в пробу цельной крови лабораторных жвотных. Регистрацию показателей ОАЭ осуществляется фотометрическим вибрационным методом. Расчетным путем определяется индекс агрегации – Ja = Ud / t, характеризующий соотношение агрегационных и дезагрегационных процессов.
Объектами исследования являются экстракты торфов, сапропелей и других сырьевых источников.
Методические рекомендации разработаны: д. б. наук Р. Т. Тухватулиным1, д.с.х.н. Л.И. Инишевой2, к.фарм.н. М.В.Гостищевой2
1 Обособленное структурное подразделение «Научно - исследовательский институт биологии и биофизики Томского государственного университета», 604050, г. Томск, пр. Ленина, 36, тел. (382 2) 529616, e-mail: tukhvatulin@mail.tsu.ru.
2 Томский государственный педагогический университет, 634041, г. Томск, пр-т Комсомольский, 75, тел. (382 2)520099, e-mail: agroecol@tspu. Edu.ru
1 Назначение и область применения. 4
5 Характеристика тест-системы и прибора. 5
6 Количественная оценка параметров тест - реакции. 6
8 Вспомогательные устройства и лабораторная посуда. 7
10 Условия безопасного проведения работ. 8
11 Требования к квалификации лиц, проводящих биотестирование. 8
12 Условия выполнения измерений. 9
13 Подготовка к проведению измерений. 9
13.1 Подготовка посуды для отбора, хранения проб и биотестирования. 9
13.2 Отбор, транспортировка, хранение и подготовка проб. 9
13.3 Подготовка тест – системы и прибора. 10
14 Процедура биотестирования. 10
14.1 Определение степени биологической активности экстрактов торфов и сапропелей. . 10
14.2 Определение степени активности исследуемого образца. 10
15 Обработка, оценка и оформление результатов. 11
15.1 Обработка результатов измерений. 11
15.2 Оценка достоверности различий результатов измерений. 11
15.3 Оформление результатов измерений. 11
16 Контроль погрешности методики оценки биологического активности. 11
17 Форма представления результатов анализа. 12
| УТВЕРЖДАЮ |
| Ректор Томского государственного университета, |
| д-р физ.-мат. наук, проф. |
| ______________ Г.В. Майер |
| «______»___________2010г |
ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ по изменению показателей обратимой агрегации эритроцитов (ОАЭ) крови
Методические рекомендации (МР) № ХХХ
___________________________________________________________________________
1 Назначение и область применения
Настоящий документ устанавливает методику количественного определения степени биологического активности торфов и сапропелей с использованием в качестве тест – системы агрегатов эритроцитов крови лабораторных животных.
Объектами исследования являются экстракты торфов и сапропелей.
Результаты работ могут быть использованы в практике мониторинга биологической активности торфов и сапропелей государственными, коммерческими, общественными и другими организациями.
Закон Российской Федерации "Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан".
Закон Российской Федерации "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".
| Биотестирование | - | проведение анализов по определению биологической активности с помощью живых организмов. |
| Обратимая агрегация эритроцитов (ОАЭ) | - | способность эритроцитов (красных кровяных телец) спонтанно образовывать агрегаты типа монетных столбиков после их механического разрушения (дезагрегации) |
| Степень биологической активности торфов и сапропелей | изменение любого показателя жизнедеятельности или функций организма под воздействием экстрактов торфов и сапропелей | |
| Тест-реакция | - | изменение какого-либо биохимического, морфологического, поведенческого или другого функционального показателя на воздействие |
| Тест-система | - | биологическая, химическая, физическая и информационная системы или их комбинации, используемые при проведении исследований |
| Тест-функция | - | жизненная функция, используемая в биотестировании для характеристики отклика тест-системы на воздействие |
Методика основана на определении изменений показателей обратимой агрегации эритроцитов по изменениям оптической плотности крови в присутствии экстрактов торфов и сапропелей в анализируемой пробе, по сравнению с контрольными значениями в пробах не содержащих экстрактов торфов и сапропелей.
Принцип действия прибора основан на свойстве крови изменять свою оптическую плотность в зависимости от степени агрегированности эритроцитов. При измерении интенсивности света, проходящего через исследуемую пробу крови, с одновременной регистрацией величины механического активности, разрушающего агрегаты эритроцитов, определяются показатели, характеризующие минимальную и максимальную механическую прочность агрегатов эритроцитов. При измерении прозрачности крови во время спонтанной агрегации определяются показатели, характеризующие скорость спонтанной агрегации эритроцитов и количество клеток, принимающих участие в процессе агрегации.
Критерием биологического активности экстрактов торфов и сапропелей являются изменения параметров ОАЭ в исследуемой пробе по сравнению с таковой для пробы, не содержащей экстрактов торфов и сапропелей (контролем). По степени отклонения параметров ОАЭ в исследуемой пробе от контрольных значений судят о степени активности экстрактов торфов и сапропелей.
5 Характеристика тест-системы и прибора
| Биотестирование | - | проведение анализов по определению степени активности экстрактов торфов и сапропелей на изменение параметров тест – системы под воздействием экстрактов торфов и сапропелей или их смесей |
| Критерий активности | - | достоверное количественное изменение параметров тест – системы |
| Тест- система | - | агрегаты эритроцитов крови лабораторных животных - in vitro |
| Тест - реакция (параметр) | - | изменение параметров тест – системы под воздействием экстрактов торфов и сапропелей или их смесей |
| Тест-функция | - | процесс обратимой агрегации эритроцитов, используемый в биотестировании для характеристики отклика крови на воздействие экстрактов торфов и сапропелей |
Тест – система – агрегаты эритроцитов крови лабораторных животных – in vitro [1]. Забор крови для исследования производят стандартным способом [2, 3, 4]. Кровь смешивают с гепарином в пробирке в объемном соотношении 9 : 1 (концентрация гепарина 50 ЕД на 1 мл крови) в количестве достаточном для измерения не менее 20 проб. Для измерения 1 пробы необходимо 50 мкл крови. Содержание тест - системы при температуре + 1 - 2 °С (в холодильной камере и (или) на тающем льду), позволяет сохранить параметры ОАЭ в течение 6 часов.
«Стационарный световой анализатор параметров обратимой агрегации эритроцитов» ТКМА 94.1112.001 является измерительным прибором, предназначенным для оценки степени биологического активности экстрактов торфов и сапропелей с использованием агрегатов эритроцитов крови лабораторных животных в лабораторных условиях. Прибор в автоматическом режиме регистрируют с высокой достоверностью чрезвычайно малые количественные изменения значений четырёх параметров ОАЭ, на основании анализа которых возможно оценить степень активности экстрактов торфов и сапропелей.
6 Количественная оценка параметров тест - реакции
Количественная оценка тест - реакции выражается в изменении параметров ОАЭ тест – системы под воздействием экстрактов торфов и сапропелей или их смесей.
На исследуемую пробу крови подаются нарастающие сдвиговые усилия. Величина локальных сдвиговых усилий, непосредственно разрушающих агрегаты, пропорциональна амплитуде колебаний стенки кюветы, которая, в свою очередь, пропорциональна величине напряжения питания вибратора, являющегося источником колебаний.