2 – выделение и получение чистых культур грибов на агаризованных питательных средах.
3 – пересев чистых культур на дифференциально-диагностические среды для последующего определения их видовой принадлежности.
Культивирование микроскопических грибов с целью накопления биомассы или определенных продуктов метаболизма предполагает:
1) наличие чистой культуры;
2) подготовку стандартного посевного материала;
3) определение условий, необходимых для роста грибов и проявления их биосинтетической активности;
Метод чистых культур
Грибы выделяют в чистую культуру и наблюдают за ними in vitro. Наличие чистых культур дает возможность определить характер роста и спорообразования у грибов, особенности морфогенеза, выявить плодовые тела и виды спороношения, установить отношение грибов к факторам среды (температуре, влажности, источникам света, кислотности среды, радиации, компонентам субстрата); определить биосинтетическую активность продуктов метаболизма (ферментов, регуляторов роста, витаминов) грибов; выявить отношение грибов к фунгицидам, лекарственным препаратам; провести сравнительную характеристику изолятов видов грибов; провести популяционные исследования; выяснить взаимоотношения грибов друг с другом, охарактеризовать степень паразитизма, родство между грибами и т.д.
Выделение фитопатогенных грибов
Прежде чем получить чистую культуру изучаемого гриба, необходимо иметь споры или мицелий, свободные от заражения сапротрофной микробиотой. Одним из наиболее простых методов получения мицелия или органов спороношения является стимулирование роста грибов и спороношения в условиях повышенной влажности – применение влажных камер. Для их изготовления обычно используют чашки Петри. Перед закладкой объекта во влажную камеру его промывают в проточной воде или в нескольких водах. Выбор концентрации дезинфектанта и времени экспозиции зависит от целей исследования и характера исследуемого материала. Стерилизуют объект, используя 3 %-ную перекись водорода, 2 %-ный раствор марганцево-кислого калия, 70 %-ный этиловый спирт. Объект выдерживают в растворе в течение 1-5 мин и многократно промывают стерильной водой. Для грубых частей растений используют обжиг в пламени.
Необходимую для проведения микологического эксперимента посуду моют с моющимися средствами, заворачивают в бумагу и стерилизуют в сушильном шкафу в течение 2 ч при температуре 180-200 °С. Инструмент стерилизуют спиртом и прокаливают на огне.
В стерильные чашки Петри кладут 2-3 фильтра, увлажненные стерильной или проточной водой (реже жидкой питательной средой). После поверхностной дезинфекции исследуемый материал помещают в чашку Петри и ставят в термостат при соответствующей температуре (обычно 20-25 °С). Фрагменты исследуемых пораженных объектов расскладывают так, чтобы они не соприкасались друг с другом.
Выделение фитопатогенных микромицетов проводят из различных пораженных органов растений.
Выделение из корней
Свежевыкопанные корни многократно промывают проточной, затем стерильной водой, отжимают в нескольких слоях стерильной фильтровальной бумаги, отрезками длиной 1-3 см или целиком (у проростков) укладывают на кружки стерильной фильтровальной бумаги в чашках Петри и помещают в термостат при температуре 26 °С. Толстые корни разрезают вдоль или нарезают небольшие поперечные отрезки. Наблюдение за ростом грибов и их выделение производят через 24-48 ч и в последующие дни роста.
Выделение из клубней, луковиц, корнеплодов, плодов
Для выделения патогенных грибов из клубней, луковиц, корнеплодов и плодов необходимы предварительный отмыв исследуемого материала от частиц почвы и поверхностная стерилизация. Срезают стерильно небольшой кусочек на границе пораженной и здоровой ткани и помещают его во влажную камеру или на агаризованную среду.
Выделение из стеблей и листьев
Грибы можно выделить не только из свежего материала, но и из гербарных образцов. Необходимо немедленно зафиксировать гербарный материал высушиванием, а также предохранять от заражения посторонней микобиотой. Листья, стебли или их части помещают в стерильный пакет из фильтровальной бумаги и высушивают в нем. После высушивания листьев пакет помещают во второй пакет, также стерильный, но из более плотной бумаги. В таком виде хранят до исследования. Перед выделением гриба материал помещают во влажную камеру.
При поражении листьев или лепестков химической обработки не ведут, а промывают несколько раз водой и увеличивают число повторностей пораженного материала.
Выделение из зерна хлебных злаков и семян
Семена дезинфицируют, если предполагают наличие внутреннего заражения. Если определяют внешнюю заспоренность, то дезинфекцию не проводят. Зерна или семена после поверхностной дезинфекции укладывают на фильтровальную бумагу через 0,5-1 см; из одной исследуемой партии зерна берут 100-1000 зерен.
Выделение грибов из почвы
1. Метод «контактных стекол» (метод Росси-Холодного) – метод выделения микроорганизмов непосредственно из места их расположения в почве. Стерильные предметные стекла прижимают к почве. Через несколько дней стекла встряхивают для освобождения от крупных комочков почвы и помещают на поверхность агаровой среды, в которую добавлен антибиотик, стороной, соприкасавшейся с почвой. Выросшие грибы просматривают при малом увеличении микроскопа и после определенного периода инкубации колонии переносят на свежую среду.
2. Метод разведения почвенной суспензии. Чаще всего для этих целей применяют разведение 1:10 (10 г почвы на 100 мл воды), 1:100, 1:1000. Суспензии с большим разведением высевают на агар.
После появления спороношения или признаков развития мицелия его пересевают на агаризованную питательную среду непосредственно в пробирку на скошенный агар или предварительно на агаризованнную среду, разлитую в чашки Петри. Для освобождения от бактерий, посевы исследуемых грибов и первичное выделение культур производят на средах с pH 4,0 с добавлением в среду для посева антибиотиков с широким спектром антибактериального действия (канамицин и др.) в концентрации 1-2 г/л питательной среды.
Облигатных паразитов выращивают на живых растениях или специальных средах.
Для дальнейшей работы очень важно провести расчистку культуры. Это осуществляется штриховой разводкой (1), разведением в стерильной воде (2) или среде (3).
1. Небольшое количество спороношения гриба снимают петлей и наносят штрихом на поверхность агара в чашки Петри. По мере продления штриха споры все более разделяются до тех пор, пока в итоге не получаются индивидуальные колонии, возникшие из нескольких или единичных спор.
2. Готовят разведения путем помещения инокулюма спор в пробирку со стерильной водой (10 мл), затем стерильной пипеткой переносят определенное количество суспензии (например, 1 мл) в пробирку с 9 мл стерильной воды. Свежая стерильная пипетка используется, чтобы смешать жидкость и перенести 1 мл ее в очередную пробирку, содержащую 9 мл стерильной воды. Разведение продолжают по мере потребности. Из последнего разведения 1 мл суспензии спор добавляют к расплавленному агару, охлажденному до 45 °С.
3. Используют пять пробирок с соответствующей средой, расплавленной и охлажденной до 45 °С. Затем в одну из пробирок вносят небольшое количество спор; пробирку вращают между ладонями и содержимое выливают в чашку Петри. Опорожненную пробирку заполняют средой из другой пробирки, вращают между ладонями и выливают во вторую чашку. Процедуру повторяют с оставшимися тремя пробирками.
Получение моноспоровых культур
При проведении теоретических исследований или анализе популяции какой-либо географической формы, выявлении продуцентов и др. возникает необходимость получения культуры из одной споры – моноспоровую культуру. Моноспоровую культуру многих грибов получают следующими способами:
1. Готовят суспензию спор на стерильном предметном стекле в стерильной воде путем погружения обожженной петли в спорулирующую культуру. Эту суспензию спор наносят штрихом вдоль намеченной линии в чашке Петри на очень тонкую пластинку агаризованной среды, приготовленной на кипяченой воде, и выдерживают при + 24 °С. Через 15-16 часов обычно наблюдают начало прорастания и готовность спор для выделения.
При работе с бинокуляром чашку Петри перемещают вдоль линии отметки и выбирают подходящие одиночные проросшие споры. Затем вырезают агаризованную среду площадью около 2 мм2 вокруг споры. Этот квадрат и зону непосредственно вокруг него проверяют при малом увеличении микроскопа, чтобы гарантировать наличие только одной споры.
Агаровый блок с проросшей спорой затем переносят при помощи стерильной иглы под бинокуляром в чашку с агаром или пробирку.
2. Питательную среду разливают тонким слоем в стерильные чашки Петри, затем берут пробирку со стерильной водой, в нее вносят небольшое количество спор исследуемого гриба и тщательно взбалтывают в воде. После этого металлической петлей берут 4-5 капель споровой суспензии и переносят на предметное стекло. Под микроскопом подсчитывают количество спор в каждой капле. Если капля заключает n спор, то в пробирку добавляют стерильную воду, чтобы объем ее увеличился в n + 1 раз.
При этом можно полагать, что в одной капле будет в среднем по одной споре. После этого из пробирки с разбавленной суспензией спор берут 3-4 капли и переносят в чашки Петри на агаризованную среду. Капли должны располагаться друг от друга на сравнительно большом расстоянии. Под микроскопом проверяют количество спор, попавшее в каждую из этих капель. Просмотр проводят с нижней стороны чашки, которую для этого осторожно переворачивают. При этом выбирают те капли, в которых содержится по одной споре и отмечают их на стекле маркером. Полученные колонии отсевают в пробирки на скошенную агаризованную среду.