Учитывая, что явление антагонизма – продукт длительной коэволюции микроорганизмов, поиск антагонистов конкретным видам патогенов следует вести в среде их совместного обитания: в почве, на поверхности надземных органов растений.
Многие исследователи, изучавшие микробное население почв, отмечают одним из первых в ряду почвенных микроорганизмов-антагонистов грибы рода Trichoderma. В настоящее время накоплен обширный экспериментальный материал по систематике, морфогенезу и споруляции, продукции метаболитов, механизмам воздействия штаммов Trichoderma на фитопатогены, свидетельствующий о высокой потенциальной активности антагонистов из этого рода почвенных грибов. Продуцируемые ими антибиотики, а также гидролитические ферменты обладают антифунгальным и антибактериальным действиями, причем некоторые из них, по-видимому, активны, будучи летучими. Всего известно более 40 видов (не считая модификаций) биологически активных веществ, относящихся к нескольким группам: октакетиды, производные метаболизма аминокислот (триховиридин, дермадин, изонитрин), пептиды (пептаиболы: трихополин и др., циклоспорины), терпеноиды (триходермин, триходермол, диацетоксисцирпенол). Под воздействием антибиотических веществ фитопатогены развиваются замедленно или вовсе не растут, снижается спорообразование, гифы искривляются, утончаются, деформируются. Кроме того, у грибов рода Trichoderma обнаружено несколько активных гидролаз (протеиназа, манназа, ламинариназа, хитиназа). Грибы рода Trichoderma проявляют в отношении ряда патогенов биотрофные свойства, проникая внутрь гиф фитопатогена с помощью тонких гиф и гаусториеподобных образований.
Взаимоотношения между грибами рода Trichoderma и фитопатогенами можно сгруппировать в пять характерных типов:
I – индифферентные (безразличные) взаимоотношения (нарастание колонии гриба рода Trichoderma на поверхность колонии фитопатогена с сохранением скорости роста обоих грибов;
II – фунгистатический алиментарный (односторонний) антагонизм (нарастание колонии гриба рода Trichoderma на поверхность колонии фитопатогена, который в этом случае прекращает активный рост);
III – территориальный антагонизм (обрастание колонии патогена грибом рода Trichoderma, обычно патоген отстает в росте);
IV – антибиотический антагонизм (замедление роста колонии патогена на расстоянии от колонии гриба рода Trichoderma, образование зоны, в которой рост патогена не наблюдается вседствие выделения антибиотических веществ грибом рода Trichoderma);
V – взаимный антагонизм (нарастание колонии гриба рода Trichoderma на поверхность колонии фитопатогена с обоюдным ингибированием скорости роста).
Быстрота роста грибов рода Trichoderma, способность их развиваться при относительно низкой температуре и широкий спектр антибиотического действия на представителей почвенной биоты в естественных условиях компенсируют сравнительно низкий титр их антибиотической активности и обеспечивают её конкурентоспособность в ризосфере растений.
Модельные эксперименты in vitro по выяснению взаимоотношений между грибами рода Trichoderma и фитопатогенами, определению антагонистической активности грибов рода Trichoderma являются прологом в процессе разработки биологических средств защиты растений от болезней.
Многие активные в отношении фитопатогенов штаммы грибов рода Trichoderma уже являются основой биопрепаратов по защите растений от патогенных организмов. Так, «Триходермин-БЛ», биопрепарат на основе антагонистически активных к патогенам штаммов гриба Trichoderma lignorum (Tode) Harz, используется для защиты овощных и зерновых культур от болезней (черная ножка, бактериозы, корневые гнили, белая гниль, фузариозное и вертициллезное увядание).
Задание:
1. Выявить in vitro типы взаимоотношений фитопатогенных грибов и грибов рода Trichoderma.
Цель опыта: Определить тип взаимоотношений in vitro фитопатогенных грибов и грибов рода Trichoderma.
Оборудование: Микроскоп, бинокуляр, пенал с набором инструментов.
Материал и условия эксперимента: Изоляты фитопатогенных грибов и грибов рода Trichoderma. Картофельно-глюкозная агаризованная среда (рН 5,5-7) (глюкоза может быть заменена сахарозой), t=20-25 °С.
Методика.
В эксперименте используется метод встречных колоний.
По дну чашки Петри провести черту, разделяющую чашку на две равные части. Залить агаризованную среду по 20 мл на чашку. В центр одной половины на расстоянии 2 см от черты поместить, засеяв гриб-патоген, на таком же расстоянии в центр другой – гриб рода Trichoderma. В контроле патоген и грибы рода Trichoderma культивируются изолированно друг от друга.
Учет результатов эксперимента необходимо проводить ежедневно, измеряя радиус колонии фитопатогена и гриба рода Trichoderma в направлении, перпендикулярном черте, делящей чашку на две равные половины. Целесообразно описывать морфологию колоний грибов, отмечать, изменяется ли окраска колоний и субстрата. Для описания окраски удобно использовать шкалу цветов А.С. Бондарцева (1953). На 5-е и 10-е сут. необходимо рассчитать показатель ингибирования (Р) фитопатогена грибом рода Trichoderma и показатель ингибирования гриба рода Trichoderma фитопатогеном:
P = ((K–A) × 100)/K, (6)
где P – показатель ингибирования, %,
К – рост гриба в контроле, мм,
А – рост гриба в опыте, мм.
В качестве показателя «рост гриба» можно использовать радиус колонии гриба в направлении, перпендикулярном черте, делящей чашку на две равные половины.
Для описания внешнего вида колонии фитопатогена на 10-е сут. можно использовать следующую шкалу:
А – патоген угнетен в сильной степени, мицелий редкий, прижатый к субстрату; Б – патоген угнетен слабо; В – патоген не угнетен.
Значком «+» рядом с буквой можно условно указать нарастание гриба рода Trichoderma на колонию фитопатогена, а значком «++» – отметить появление на колонии патогена очагов спороношения гриба рода Trichoderma.
На 10-е сут. необходимо определить тип взаимоотношений фитопатогена и гриба рода Trichoderma, а также оценить в баллах степень нарастания гриба рода Trichoderma на колонии фитопатогенов:
0 – нет нарастания колонии гриба рода Trichoderma на колонию патогена,
1 – гриб рода Trichoderma занимает до 25 % площади колонии патогена;
2 – гриб рода Trichoderma занимает 25-50 % площади колонии патогена;
3 – гриб рода Trichoderma занимает 51-75 % площади колонии патогена;
4 – гриб рода Trichoderma занимает 76-100 % площади колонии патогена.
Для установления типа взаимоотношений исследуемых грибов нужно произвести микроскопирование зоны совместного роста колоний патогена и гриба рода Trichoderma.
Результаты эксперимента необходимо обработать статистически и представить в виде таблиц 7-10.
Таблица 7
Радиус колонии (мм) исследуемых грибов
| Вид, штамм гриба | Время измерения, сут. | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
Таблица 8
Показатель ингибирования (%) фитопатогена грибом рода Trichoderma
| Вид, штамм гриба | Время рассчета, сут. | |
| 5 | 10 | |
Таблица 9
Показатель ингибирования (%) гриба рода Trichoderma фитопатогеном
| Вид, штамм гриба | Время рассчета, сут. | |
| 5 | 10 | |
Таблица 10
Антагонистическая активность грибов рода Trichoderma
| Штамм гриба рода Trichoderma | Внешний вид колонии патогена | Степень нарастания колонии гриба рода Trichoderma, балл |
ЗАНЯТИЕ 6
Тема: Антагонисты фитопатогенов среди эпифитных и ризосферных бактерий родов Bacillus и Pseudomonas
Цель: Ознакомиться с особенностями антагонистического влияния эпифитных и ризосферных бактерий родов Bacillus и Pseudomonas на фитопатогенные микромицеты.
Бактерии также могут воздействовать на фитопатогенные грибы, подавляя их развитие. Поэтому бактериальным штаммам-антагонистам отводится важная роль в биологическом контроле патогенных микроорганизмов в агрофитоценозах. Преимущество использования бактерий-антагонистов заключается в их способности продуцировать высокоактивные антимикробные вещества, в том числе сидерофоры, антибиотики, ферменты, угнетающие рост и развитие патогенной биоты.
Cреди микроорганизмов бактериальной природы весьма перспективными в качестве антагонистов фитопатогенных грибов считаются флюоресцирующие псевдомонады (род Pseudomonas). Многие ризосферные бактерии из рода Pseudomonas способны синтезировать и выделять в среду желто-зеленые пигменты, называемые пиовердинами, выполняющие в клетках функции сидерофоров. Данные вещества способны связывать ионы трехвалентного железа и облегчать транспорт их в клетку в условиях железодефицита, делая комплекс пигмент-Fe3+ недоступным для других организмов. Ионы железа, участвуя в окислительно-восстановительных реакциях, являются необходимыми в таких процессах, как дыхание, фотосинтез, фиксация молекулярного азота, и без них невозможно существование бактериальной клетки. Доступность железа и способность различных микроорганизмов конкурировать за него, являются факторами, контролирующими численность и состав группировок микроорганизмов. Благодаря этому флуоресцирующие пигменты ризосферных бактерий проявляют одновременно антибактериальную, антифунгальную и антинематодную активность.