Результаты исследования во многом зависят от точности соблюдения методики пробоотбора биологической жидкости, условий хранения пробы и транспортировки, погрешности метода, ошибок при проведении исследований. С учетом сказанного обнаружение алкоголя в биологической жидкости в концентрации ниже 0,3 град./оо не может достоверно свидетельствовать о факте употребления алкоголя.
Забор биологических сред у лиц, освидетельствуемых для установления состояния алкогольного опьянения, должен проводиться в любое время суток.
Взятие крови и мочи у лиц, подозреваемых или обвиняемых в совершении правонарушений, а также у потерпевших производится в порядке, установленном ст. ст. 141 и 186 УПК РСФСР и соответствующими статьями союзных республик.
Моча отбирается в сухой стерильный флакон из-под пенициллина "под пробку". Флакон тотчас же закрывают пробкой. Отбор пробы мочи должен производиться в условиях, исключающих подмену или замену ее другими жидкостями.
Слюна отбирается в стерильный сухой флакон из-под пенициллина в количестве 5 мл и тут же закрывается пробкой.
У всех флаконов с отобранными пробами фиксируют пробки алюминиевыми колпачками с помощью приспособления для обжима колпачков (ПОК-1), обеспечивающего герметизацию флакона, и ставят их в холодильник. В случае герметизации другим способом флаконы должны быть опечатаны. На каждый флакон наклеивается этикетка с указанием номера пробы (по регистрационной книге), даты, времени забора пробы, фамилии освидетельствуемого, фамилии медицинского работника, подготовившего пробу.
Перед отбором пробы крови в сухой стерильный флакон из-под пенициллина закапывают 1 - 2 капли гепарина или 0,8 мл 3,8%-го раствора цитрата натрия и встряхиванием флакона смачивают его стенки.
Кровь в количестве 5 мл отбирается пункцией кубитальной воды при строгом соблюдении асептических условий самотеком во флакон, обработанный гепарином или цитратом. Флакон тотчас же закрывают стандартной резиновой пробкой, фиксируют пробку и содержимое флакона перемешивают. Кожа в месте пункции предварительно обрабатывается раствором сулемы 1 : 1000 или риванолом 1 : 500. Дезинфекция кожи спиртом, эфиром, настойкой йода или бензином не допускается.
Данные о взятии мочи, слюны или крови заносятся в журнал регистрации анализов и их результатов (форма N 250/у, утвержденная Приказом Минздрава СССР от 04.10.80 N 1030). При этом указываются: порядковый номер, дата и время взятия мочи, крови или слюны; фамилия, имя, отчество врача, производившего взятие пробы крови (откуда взята кровь и способы обработки кожи), количество взятых биосред, дата и время передачи биосред на анализ, дата проведения исследования, результаты исследования. Листы регистрационного журнала должны быть пронумерованы, прошнурованы и скреплены сургучной печатью учреждения.
Пробы биологических сред следует хранить в холодильнике при температуре не ниже -4 град. С.
В лабораторию пробы мочи, крови и слюны передаются с направлением, в котором указаны порядковый номер пробы (по регистрационной книге), наименование, количество, дата и время взятия биосред, условия хранения, цель анализа, Ф.И.О. направившего врача, адрес направившего учреждения.
Биосреды, как правило, должны исследоваться не позднее суток с момента их отбора. Допускается их хранение до исследования в холодильнике при температуре не ниже -4 град. С в течение 5 суток. При длительном хранении биосред с нарушением температурного режима хранения в них развиваются бродильные и гнилостные процессы, которые могут существенно исказить результаты количественного определения.
Часть исследуемой среды (из флакона) используют для определения этилового алкоголя, оставшуюся часть хранят в холодильнике для возможных контрольных исследований в течение 35 дней.
Склянки (пробирки), предназначенные для взятия крови и мочи, моются 2%-ным раствором соды, ополаскиваются дистиллированной водой и стерилизуются обычным способом.
В настоящее время для количественного определения алкоголя в биологических жидкостях в нашей стране используются методы фотоколориметрии и газожидкостной хроматографии.
Первый из них недостаточно избирателен к алкоголю, обладает значительными погрешностями, однако до сих пор используется в отдельных лечебных учреждениях в тех случаях, когда не представляется возможным анализ более избирательным и точным способом.
В кабинете медицинского освидетельствования для установления факта употребления алкоголя и состояния опьянения количественное определение алкоголя в биологических жидкостях должно производиться методом газовой хроматографии. Этот метод обладает высокой специфичностью и точностью.
Среди известных хроматографических методик для определения алкоголя в биологических жидкостях к настоящему времени Минздравом рекомендованы к использованию две модификации нитритного метода (см. Методическое письмо N 10-95/14-32 от 22.04.68 с Дополнениями от 12.08.71 и методические указания о повышении качества исследований при количественном определении этилового спирта в крови и моче (1977 г.), а также методику, излагаемую ниже).
Сущность нитритного метода заключается в превращении спиртов в алкилнитриты, более летучие, чем спирты, и в дальнейшем хроматографировании алкилнитритов. Разделенные на хроматографической колонке компоненты смеси последовательно поступают в детектор по теплопроводности - катарометр, сигналы которого регистрируются в виде ряда хроматографических пиков на хроматограмме. Идентификация веществ производится по времени их удержания, которое исчисляется от момента введения анализируемого вещества в колонку до появления максимума пика. Чувствительность для этилового спирта составляет 0,01%. Расчет концентрации этилового алкоголя производят после калибровки по методу внутреннего стандарта. Внутренним стандартом служит изопропиловый спирт.
Для работы могут быть использованы отечественные газовые хроматографы ЛХМ-8МД, ЛХМ-80, "Цвет-100", 102, 106, 162 и другие, комплексованные детектором по теплопроводности (катарометром).
3.1.12. Методика определения этилового спирта *
Газовый хроматограф с детектором по теплопроводности. Газ - носитель: гелий, скорость потока: 24 мл/мин. Колонка металлическая, диаметром 3 мм и длиной 2 м, температура колонки 60 град. С. Твердый носитель (ТН) - целит С-22, фракция 60 - 80 меш, модифицированный металлическим серебром. Неподвижная фаза (НФ) - полиэтиленгликоль - 1500. Соотношение НФ к ТН - 1 : 10.
Примечание. В приборах с раздельными термостатами детектора и колонок температура термостата детектора - 100 град. С.
3.1.13. Подготовка твердого носителя
В качестве твердого носителя можно использовать любые вещества на основе кизельгура (целиты, хромосорб, хромотон, цветохром и т.п.) с размером частиц 0,16 - 0,20 мм, предварительно модифицированные слоем металлического серебра.
Модификация металлическим серебром проводится в следующем порядке: 0,2 г нитрата серебра растворяют в 3 - 4 каплях воды и добавляют 25 мл этанола. Раствор переносят к круглодонную колбу со шлифом и к раствору добавляют 10 г твердого носителя. Колбу присоединяют к вакуумному насосу на 25 - 30 мин. Затем колбу помещают на водяную баню (80 - 90 град. С) и отгоняют 10 - 15 мл спирта. Колбу снимают с бани и отсоединяют от вакуумного насоса. При постоянном перемешивании в колбу вносят 5 мл 10%-ного раствора аммиака. Колбу присоединяют на 15 - 20 мин. к вакуумному насосу. После отключения насоса в колбу вносят 3 мл раствора формальдегида, перемешивают и помещают на 5 мин. в водяную баню при постоянном перемешивании. Затем твердый носитель промывают декантацией горячей дистиллированной водой и переносят на сито. Твердый носитель на сите промывают водой до нейтральной реакции, затем свежеприготовленным 1%-ным раствором едкого калия, и раствору дают свободно стечь. После этого твердый носитель сушат при 90 - 95 град. С досуха, а затем прокаливают 3 часа при 160 - 180 град. С.
Приготовленный твердый носитель сохраняют в склянках с притертой пробкой.
Примечание. Перемешивание твердого носителя осуществляется только (!) вращением колбы, применение стеклянных палочек или мешалок недопустимо.
3.1.14. Нанесение неподвижной фазы
В выпаривательной чашке растворяют 1 г неподвижной фазы в 20 мл перегнанного хлороформа и в раствор вносят 10 г подготовленного твердого носителя. Содержимое перемешивают покачиванием в течение 8 - 10 мин. и чашку помещают на водяную баню с температурой 60 - 65 град. С при постоянном перемешивании до полного удаления растворителя и отсутствия запаха хлороформа.
Подготовку твердого носителя и нанесение неподвижной фазы можно производить на ротационном испарителе.
3.1.15. Заполнение и кондиционирование колонок
Перед кондиционированием с помощью бюретки с дистиллированной водой или расчетным путем измеряют объем колонки и снабжают ее биркой с указанием объема колонки, наименования твердого носителя, неподвижной фазы и даты заполнения.
Незаполненные хроматографические колонки предварительно промывают раствором жидкого детергента, ополаскивают дистиллированной водой, промывают спиртом, эфиром и хлороформом, продувают воздухом и прокаливают в сушильном шкафу при 200 - 250 град. С в токе инертного газа в течение 2 часов.
Новые колонки необходимо после прокаливания установить в прибор, включить газ - носитель и проверить герметичность соединений.