Заполняют колонку "под иглу" точно измеренным количеством наполнителя (твердый носитель с нанесенной неподвижной фазой). Заполненные колонки присоединяют к блоку ввода пробы, оставляя свободным второй конец, устанавливают поток газа - носителя 24 мл/мин., проверяют герметичность и термостатируют, повышая температуру от 50 град. С до 90 град. С ступенчато - 10 град. в час. После чего устанавливают температуру 90 град. С и кондиционируют 24 часа. Только после кондиционирования отключают термостат, охлаждают до комнатной температуры и подсоединяют колонку к детектору.
Подготовленная по описанной выше методике колонка работоспособна более одного года при условии соблюдения температурного режима (не меньше 95 град. С и чистоты газа - носителя. Необходимо также избегать перегрузки колонок большим количеством исследуемой пробы (т.е. более одного см3 парогазовой фазы или 5 мкл жидкой пробы).
После кондиционирования колонки проводится проверка ее эффективности.
3.1.16. Определение метрологических характеристик
Оценка точности газохроматографических измерений проводится в соответствии с Методическими рекомендациями "Методика по нормированию метрологических характеристик, градуировке, проверке хроматографических приборов универсального назначения, по оценке точности результатов хроматографических измерений", изд. Стандартов, М., 1978.
3.1.17. Методика обнаружения этанола в биологической пробе
Во флакон из-под пенициллина, содержащий 0,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты, вносят 0,5 мл исследуемой пробы. Флакон закрывают стандартной резиновой пробкой и фиксируют алюминиевым колпачком с помощью ПОК (прибор для обжима пенициллиновых флаконов).
После энергичного перемешивания во флакон шприцем вводят 0,35 мл раствора нитрита натрия. Содержимое флакона энергично встряхивают (30 маятникообразных движений) и оставляют на 1 минуту. Затем из флакона шприцем путем прокола пробки отбирают 0,5 мл парогазовой фазы, которую тотчас же вводят в прибор. С помощью секундомера измеряют время удерживания от начала выхода пика несорбирующегося компонента (воздуха) до максимума измеряемого пика. Это время удерживания вещества в колонке. При наличии в исследуемой крови алифатических спиртов на хроматограмме появляются пики соответствующих алкилнитритов.
3.1.18. Количественное определение
Количественный анализ проводят с помощью калибровки по методу внутреннего стандарта, используя для расчета отношение высот пика этанола к пику изопропанола. Калибровочный график для количественных исследований строят ежедневно, т.к. при повторном включении прибора условия хроматографии могут изменяться. График зависимости от концентрации этанола строят по 3 - 4 точкам, используя точные растворы этилового спирта в воде.
Для построения графика используются эталонные растворы этанола в концентрации 0,4 - 2; 0 - 4,0%, которые подвергаются газохроматографическому исследованию в тех же условиях, что и исследуемые пробы. На графике на оси абсцисс откладываются значения соотношения высот пиков этилнитрита к пропилнитриту (изопропилнитриту), во избежание дробных чисел среднее значение соотношения высот пиков для каждой концентрации этанола умножают на 100. Масштаб: 1 см = 0,1. На оси ординат - соответствующие им значения концентрации эталонных растворов. Масштаб: 1 см = 0,4%.
Пробу биологической среды подготавливают к вводу в прибор следующим образом: во флакон из-под пенициллина, содержащий 0,5 мл трихлоруксусной кислоты, вносят 0,5 мл раствора изопропанола (внутренний стандарт) и 0,5 мл исследуемой пробы; флакон закрывают стандартной пробкой. Пробку фиксируют. Содержимое флакона перемешивают и во флакон шприцем вводят 0,35 мл раствора нитрита натрия. Флакон энергично встряхивают (30 маятникообразных движений) и оставляют на 1 минуту. После чего из флакона шприцем путем прокола пробки отбирают 0,5 мл парогазовой фазы, которую тотчас же вводят в прибор. Для получения достоверных результатов проводят три параллельных исследования. На хроматограмме измеряют высоту пиков.
Для расчета концентрации этилового спирта удобнее пользоваться величиной f - фактор чувствительности.
3.1.19. Приборы и оборудование
1. Газовый хроматограф ЛХМ-8МД, ЛХМ-80, Цвет-100 и другие с детектором по теплопроводности. Колонки - 2 м. 2. Баллоны металлические для хранения сжатых газов (гелия или азота) - 3шт. 3. Водоструйный насос, или вакуумный насос, или электроотсос хирургический - 1 шт. 4. Редукторы газовые 3 шт. 5. Шкаф сушильный с диапазоном температур 50 град. С - 240 град. С - 1 шт. 6. Приспособление для обжима алюминиевых колпачков К-1 - 1 шт. 7. Секундомер - 1 шт. 8. Шприц типа "Рекорд" на 1 мл, обязательно с силиконовым уплотнением (Chirana, ЧССР) - 1 шт. 9. Иглы к шприцам типа "Рекорд", например, А-04, 20-1-15 для отбора парогазовой фазы) и 0806 (для ввода) - 1 компл. 10. Шкаф вытяжной - 1 шт. 11. Холодильник бытовой - 1 шт. 12. Мойка для мытья лабораторной посуды (двухсекционная) - 1 шт. 1. Колба мерная на 1 л - 50 шт. 2. Колба мерная на 100 мл - 10 шт. 3. Стакан мерный на 100 мл - 5 шт. 4. Склянка с притертой пробкой на 100 мл - 10 шт. 5. Пипетки мерные на 1, 2, 5, 10 мл со знаком аттестации Госстандарта - по 100 шт. 6. Флаконы из-под пенициллина с пробками - 500 - 1000 шт. 7. Колпачки алюминиевые - 500 - 1000 шт. 8. Колба круглодонная со шлифом N 29 на 0,5 л - 10 шт.3.1.21. Химические реактивы (на 2000 анализов в год)
1. Целит С-22, целит 545, или хромотон, или хромосорб с зернением 60 - 80 меш. (0,16 - 0,20 мм) - 25 см3 2. Полиэтиленгликоль 1500 (ПЭГ-1500) - 3 г 3. Серебра нитрат "хч" - 3 г 4. Натрия гидрат окиси "хч" - 15 г 5. Натрия сульфат безводный "хч" - 10 г 6. Натрия нитрит "хч" - 60 г - 30 г натрия нитрита в мерном стакане доводят дистиллированной водой до 100 мл. Хранят в склянке из темного стекла в холодильнике. 7. Трихлоруксусная кислота "чда", "хч" - 500 г, 50 г трихлоруксусной кислоты в мерном стакане доводят дистиллированной водой до 100 мл. Хранят в склянке из темного стекла при комнатной температуре.8. Аммония гидрат окиси, 25%-ный раствор - 25 мл 9. формальдегида 40%-ный раствор - 25 мл 10. Хлороформ (перегнанный) - 100 мл 11. Изопропанол "осч" для ГХ - 4 мл. 0,4 мл изопропанола в мерной колбе доводят дистиллированной водой до 100 мл. Хранят в склянке с притертой пробкой в холодильнике 5 суток. 12. Едкое кали "хч" - 100 мг 13. Этиловый спирт для приготовления эталонных растворов- 2 млПредварительно спиртометром измеряются процент (объемный) исходного алкоголя. По алкоголеметрической таблице (Государственная фармакопея) объемные проценты переводятся в весовые с указанием удельного веса. Затем производится расчет необходимого количества алкоголя для приготовления 10%-ного раствора спирта.
Для приготовления эталонного раствора в концентрации 0,4% пипеткой отмеривается 2 мл раствора спирта, количественно переносится в мерную колбу емкостью 50 мл и разбавляется дистиллированной водой до отметки. Для приготовления 2%-го раствора берется 10 мл 1%-ного раствора спирта, а для приготовления 4% эталонного раствора берется 20 мл 1% раствора спирта, дальнейшее разведение осуществляется как указано выше.
Эталонные растворы хранятся в склянках темного стекла с хорошо зашлифованными пробками при температуре +4 - +6 град. С. При пользовании эталонными растворами следует как можно меньше оставлять их открытыми. Перед открыванием склянки с этанолом ее необходимо тщательно встряхнуть. При соблюдении этих условий эталонные растворы могут использоваться в течение 5 - 10 дней, практически не теряя своей концентрации. По истечении этого срока приготавливаются новые эталонные растворы.
3.2. Изменение концентрации этанола во внутренних органах трупа в ранние сроки посмертного периода.
В крови и моче трупа при острой алкогольной интоксикации уже в ранние сроки (несколько суток) после наступления смерти наблюдают как снижение содержания этанола за счет окисления и испарения, так и его повышение обусловленное диффузией и процессом новообразования. В тех случаях, когда не удается получить пробы крови и мочи (при исследовании расчлененных и гнилостно-измененных трупов), важное значение приобретает исследование этанола во внутренних органах трупа. Трактовка полученных при этом результатов всегда представляет значительные трудности, особенно в случаях со значительным сроком посмертного периода.
В связи с этим в эксперименте и на секционном материале изучены изменения концентрации этанола в ранние сроки посмертного периода в различных внутренних органах трупа при острой алкогольной интоксикации.
Основной целью исследования явилось установление конкретных внутренних органов, в которых происходят минимальные изменения концентрации этанола в посмертном периоде.
Эксперименты проведены на 125 белых крысах обоего пола, массой 300-380 г, содержащихся в виварии на обычном пищевом режиме. Животным через зонд внутрижелудочно вводили по 6 мл 70% раствора этанола. Такая доза была обусловлена необходимостью обеспечить максимальное насыщение внутренних органов животных этанолом, не вызывая при этом их гибели в ближайшие часы после затравки. Через 2 ч после затравки (в конце фазы резорбции) животных забивали и сразу же подвергали вскрытию для взятия проб органов, без их эвисцерации. Для исследования брали головной мозг, миокард (левый желудочек), печень, почку, мышечную ткань (бедро). На желудок накладывали лигатуры, часть желудка иссекали, для исследования брали отмытый участок стенки желудка. Содержимое этанола определяли методом газожидкостной хроматографии. После взятия проб для исследования головной мозг помещали в брюшную полость; переднюю брюшную стенку ушивали.
Учитывая, что характер изменений содержания этанола в органах трупа в значительной степени зависит от температуры окружающей среды, мы провели 2 серии экспериментов. В первой серии (77 животных) трупы сохраняли при комнатной температуре (18 – 22оС). После затравки и забоя животных ежедневно (на протяжении 5 сут) из трупов животных (по 12 – 20 крыс) повторно брали пробы тех же органов. Во второй серии опытов (48 крыс) трупы животных хранили при более низких температурах (4 – 6оС) в условиях холодильника. При этом материл для повторного исследования брали из трупов животных (по 5 – 10 крыс) на 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 е сутки посмертного периода.