Через два роки з’являється Новий Завіт разом із Псалтирем. 5 травня 1581 р. виходить суто шкільне видання — так звана Хронологія Андрія Римші — перелік назв місяців року церковнослов’янською, гебрайською і українською мовами. До кожного з них було додано вірш на сюжет із Старого Завіту.
Звертає на себе увагу Книга Нового Завіту, яку видавці підкреслено величають "яко пръвый овощ от дому печатного" К.-В. Острозького. [48, 37]
На високий науково-методичний рівень було поставлено навчання церковнослов’янської. Підготовка до публікації Біблії стимулювала тут вироблення певних сталих граматичних засад, ознайомлення з тогочасною європейською мовознавчою думкою. Отже, в Острозькій академії вперше серед українських шкіл викладання велося церковнослов’янською, грецькою та латинською мовами. Відповідно до вимог часу студенти могли знайомитись із основами права, зокрема церковного (останнє засвідчує культивоване в Острозі переписування "Кормчої").
Починаючи з 1583 р., Острозьку школу сучасники часто називали "Академією", зокрема так про неї писали фундаторка Галшка Острозька, ректор Герасим Смотрицький, ідеологічний супротивник Іпатій Потій, укладач інвентарю міста 1620 р. Фактично вона була середнім навчальним закладом. У певні періоди, за наявності висококваліфікованих фахівців могли впроваджуватись і окремі курси академічного рівня. У тодішніх умовах навіть магнат К.-В. Острозький не зміг би добитися для своєї школи, антикатолицької за спрямуванням, прав вищого навчального закладу. Згідно з європейською практикою прерогатива надання університетських прав належала королеві (при апробації папи римського і сейму). До того ж вже існуючі академії всіляко чинили опір виникненню нових, конкурентних шкіл. Однак формальна невизначеність статусу закладу, його приватний характер опосередковано сприяли виникненню вперше в Україні світської публічної школи, незалежної не тільки від державних чинників та костьольної ієрархії, але навіть від православної церкви. Світськими людьми були викладачі (бакалаври), більшість ректорів. Фактично в Острозі вперше було подолано монополію церкви в українській освіті.[48, 46]
В історії академії можна окреслити три періоди. Перший, час формування (1576 — 1586), характеризується значним інтелектуальним спалахом — випуском першої церковнослов’янської Біблії (1581) [59, 36-37].
Уже тоді простежується унікальна ознака Острозького культурно-освітнього центру (який, окрім академії, включав ще літературно-публіцистичний гурток та видавництво). Це залучення до співпраці діячів різних конфесій, ідеологічних та політичних орієнтацій, яке відбувалося за умов домінуючого православного спрямування діяльності осередку. Тут перебували православні — українець Герасим Смотрицький та росіянин Іван Федоров; випускник Римського Грецького колегіуму (однак активний антипапіст) грек Мануїл Мосхопулос, протестанти — білорус Андрій Римша і українець Мотовило, проватиканськи настроєні греки Діонісій Раллі та Євстахій Нафанаїл. [48, 50-53]
Наступний період діяльності академії (1587 — 1608) — час її розквіту. Саме тоді до Острога та підпорядкованих йому культурно-ідеологічних осередків було запрошено цілу плеяду видатних особистостей свого часу — українців та іноземців. Винесений ними з відомих європейських університетів, протестантських чи католицьких середніх шкіл науковий та педагогічний досвід, слід думати, був втілений у діяльності Острозької академії. Адже українець Кипріян вчився в Падуанському університеті, Ісакій Борискович — в Александрійській патріаршій школі, львів’янин, за народженням грек, Мануїл Ахілеос закінчив римську Афанасіївську колегію. З-поміж пов’язаних з Острогом вихованців Падуанської академії вирізнялися греки Никифор Кантакузин та Кирило Лукаріс, пізніше Александрійський та Константинопольський патріарх.
Залучення наукових кадрів та викладачів з-поза кордону відбувалося двома хвилями. Перша пов’язана із заснуванням колегії і підготовкою до випуску Біблії, наступна припала на другу половину 90-х рр. XVI ст. Один із списків Святого Письма з Батикану привіз грек Діонісій Раллі. 1579 р. Євстахій Нафанаїл перекладав тексти до Біблії; Мануїл Мосхопулос теж брав участь у підготовчих роботах. Очевидно, тоді до гуртка входили і Тимофій, єпископ міста Пула, могленський єпископ Феофан Грек та ін.[48, 49-52]
У жодному з культурно-ідеологічних центрів України XVI — XVII ст. не побувало стільки впливових, здебільшого високоосвічених особистостей православного Сходу та Балкан. Гості консультували перекладачів, сприяли налагодженню книжних контактів з тими краями, звідкіля походили чи де посідали церковні посади.
З академією співпрацювали і польські діячі, забезпечуючи відповідний рівень викладання польською і латинською мовами. Вирізнявся Ян Лятош (1539 — 1608) — астроном, математик, доктор медицини, випускник Краківського та Падуанського університетів. Через конфлікт з консервативними католицькими колами він змушений був покинути викладання у Краківському університеті й останні десять років свого життя провів у Острозі. [48, 53-55]
Авторитет Острогу принесли і українці-самоуки, визнані православні публіцисти Герасим Смотрицький, Іван Вишенський, Василь Малюшицький (Суразький), Клірик Острозький, протопоп Ігнатій, літератор Дем’ян Наливайко, друкарі, книжники. З другої половини 90-х рр. XVI ст. Острог об’єднав блискучі інтелектуальні сили України та з-поза її меж. В ньому сформувалася перша наукова установа України (філологічного профілю), найпотужніше тогочасне українське видавництво[59, 38].
Підготовка в стінах академії Біблії ініціювала вироблення певного стандарту церковнослов’янської мови для всіх слов’яно-православних народів у XVI — XVII ст. Це ж відбувалося і під час навчального процесу. Тому закономірно, що саме випускник академії Мелетій Смотрицький створив церковнослов’янську "Граматику" 1619 р. — найвідоміший твір давнього українського мовознавства. В ній він використав особистий мовознавчий досвід і лінгвістично-педагогічну практику своєї "альма-матер".
Великим досягненням у діяльності школи було певне внормування й української книжної мови. Цьому сприяв Дем’ян Наливайко, який послідовно супроводжував церковнослов’янські тексти своїх публікацій перекладами на українську мову.
Для потреб освіти водночас з академією в Острозі була заснована і друкарня. Частина видань готувалася викладачами, а низка книжок призначалася для початкових класів школи (церковнослов’янські та грецькі букварі, Катехізис , поетичні твори). Організував видавництво близько 1578 р. засновник друкарства на землях України росіянин Іван Федоров. Він же очолив гурт технічних працівників, що випустив у світ шедевр давньоукраїнської поліграфії — Острозьку Біблію 1581 р.[33, 21-22]
Надалі керували видавництвом місцеві діячі: полеміст Василь Малюшицький-Суразький, вчитель Дем’ян Наливайко. При академії та пов’язаних із нею осередках книжки і копіювались, внаслідок чого виробилася своя школа скоропису. Правдоподібно, що якісь характерні риси були притаманні книгам, скопійованим тут півуставом.
В Острозі виник відомий згодом "острозький" напів. Рівночасно спостерігається і високий розвиток світської музики, в місті засновується цех музикантів, явище рідкісне для України. 1624 р. в Острозі зафіксовано навіть цех скрипалів, а 1635 р. лише в половині міста Острога згадано аж "музыков 22 посполитых"[59, 41-42].
Академія мала позитивний вплив на розвиток вищих українських шкіл, зокрема Волині. До них йшли вчителями випускники академії, постачалися учбові видання, рукописи із Острога. При реорганізації з ініціативи К.-В. Острозького Володимирської присоборної школи 1588 р. було засновано фундації для підготовки грецьких та слов’янських бакалаврів.
Занепад академії, як і всього центру, розпочинається після смерті 1608 р. її патрона К.-В. Острозького, коли місто перейшло до спадкоємців-католиків. В академію вже не мали змоги приїжджати висококваліфіковані викладачі чужинці; почався розпад літературно-публіцистичного гуртка, згортала свою діяльність друкарня. Цей процес розтягнувся десь на десять років. Ще 1610 р. виготовляє список свого перекладу із грецької мови на церковнослов’янську знаний філолог Кипріян. А через рік анонімний учень академії виконує досить складний переклад із греки книги полемічних творів Федора Авукара, за якою він попередньо їздив аж в Аравію. 1612 р. датовано останнє острозьке друковане видання. Надалі переклади острозьких діячів виходять у світ уже в київській та білоруських друкарнях. Висококваліфікованих викладачів школи замінили її вихованці чи випадкові особи. [59, 67-71]
На початку 1621 р., із переходом частини міста у власність онуки К.-В. Острозького Анни-Алоїзи Ходкевич, настав останній період історії школи. Інспірована єзуїтами княжна розпочала нагінки вчителів, заборонила викладати латинською та польською мовами, позбавила колегію дотацій, чим звела її до рівня початкової школи. Кошти на утримання вчителів академії, як і острозького шпиталя, були записані на Суразькому маєткові. Тому княжна 1624 р. спершу половину суми (180 злотих) передала польській школі. Згодом відібрала і решту.