Схема проведения бактериологического исследования включает «обогащение» исследуемого материала при низкой температуре, использование дифференциально-диагностических сред для выделения и идентификации культур, определение их биотипа, серотипа, вирулентности.
Несмотря на низкую эффективность, прямой посев нативного материала на плотные питательные среды проводят, как правило, при подозрении на инфицированность иерсиниями продуктов питания и/или при групповых заболеваниях, вызванных употреблением (инфицированных) продуктов. Для этой цели эффективнее применение дифференциально-диагностическая среда для выделения иерсиний с бромтимоловым синим (СБТС).
При проведении «холодового обогащения» исследуемый материал в пептонно-калиевой среде (ПК) помещают в холодильник и выдерживают в нем до первого положительного посева, но не более 10 дней.
Высев на плотные питательные среды проводят со среды ПК на 2-3, 5-7 и 10 сутки. Высевы производят петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхности). Перед посевом содержимое пробирок не взбалтывают. При использовании среды Эндо и/или исследовании загрязненных проб, особенно при массовом поступлении, для ингибирования роста посторонней флоры, проводят щелочную обработку. Методика щелочной обработки основана на относительной резистентности иерсиний к щелочи по сравнению с другими микроорганизмами.
Методика щелочной обработки
Щелочная обработка проб проводится перед каждым высевом со среды ПК на плотную питательную среду. В лунки полистироловых планшетов для иммунологических реакций вносят по 0,2 мл свежеприготовленного 0,72 % раствора КОН в 0,5 % растворе NaCl и 0,2 мл исследуемого материала, перемешивают, выдерживают 1-1,5 минуты и высевают на СБТС или среду Эндо. Посевы инкубируют при (26±2) оС.
Просмотр выросших колоний проводят, как правило, через 48 ч, учитывая их морфологию (таблица 5).
Биохимическая идентификация
Видовую принадлежность выделенных культур устанавливают на основании комплекса типичных морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и других свойств.
Для предварительного отбора используют стабильный биохимический признак – наличие уреазы. Положительный уреазный тест позволяет отличить иерсиний от других видов патогенных кишечных бактерий – шигелл, сальмонелл, эшерихий и др. Отсев подозрительных колоний проводят на скошенный столбик среды Олькеницкого штрихом и уколом в столбик. Как и иерсинии, бактерии рода Proteus гидролизуют мочевину, но они, в отличие от Yersinia, всегда расщепляют триптофан.
Ферментативная активность исследуется обычным способом на средах Гисса при 28 оС; подвижность в 0,3 % полужидком агаре и реакция Фогес-Проскауэра (среда Кларка) – при 25 и 37 оС.
Таблица 4
Материал для исследования и его подготовка
| Вид исследуемого материала | Кол-во, сроки | Правила взятия, подготовка к исследованию бактериологическим методом и методом ИФА | Правила взятия, подготовка к исследованию в ПЦР |
| Материал от больных | |||
| Испражнения* | 0,5-1,0 г на протяжении всего периода заболевания | Стерильной деревянной палочкой из судна; ректальным зондом. Поместить в 5,0 мл среды накопления (ПК). | В одноразовый контейнер с 5-10 мл забуференного физ. р-ра (ЗФР) рН 7,2-7,4, ложечкой, прилагаемой к контейнеру |
| Моча* | 20-30 мл средней порции утренней мочи в первые 7 дней болезни | Засевается осадок после центрифугирования или отстаивания; для ИФА осадок исследовать нативно, затем поместить в 5,0 мл среды накопления | В одноразовый контейнер |
| Смыв из зева | В первые 3 дня болезни | Натощак с задней стенки глотки и корня языка тампоном, смоченным в физ. р-ре. Тампон поместить в 5,0 мл среды накопления | Тампон помещают в одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР |
| Кровь | 5-10 мл в первые 3 дня болезни | Стерильно из локтевой вены; сгусток измельчить, поместить 1 мл в 5,0 мл среды накопления | В одноразовую пробирку |
| Операционный или секционный материал | |||
| Аппендикулярные отростки | 1,0-2,0 г | Стерильно измельчить, 1 мл суспензии поместить в 5,0 мл среды накопления | В одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР |
| Мезентериальные лимфоузлы, др. органы и ткани | 1,0-2,0 г | Стерильно измельчить, 1 мл суспензии поместить в 5,0 мл среды накопления | В одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР |
| Желчь | 1,0-2,0 мл | Собрать в пробирку 0,5-1,0 мл, поместить в 5,0 мл среды накопления | |
| Содержимое кишечника | 0,5-1,0 г | Собрать в пробирку 0,5-1,0 мл, поместить в 5,0 мл среды накопления | В одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР |
| Сгусток крови | 0,5-1,0 мл | Стерильно измельчить, 1 мл поместить в 5,0 мл среды накопления | В одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР |
* - высеваемость иерсиний наиболее высока в первые 3-5 дней болезни и до назначения антибиотиков
| Вид исследуемого материала | Кол-во, сроки | Правила взятия, подготовка к исследованию бактериологическим методом и методом ИФА | Правила взятия, подготовка к исследованию в ПЦР |
| Материал от животных и птиц | |||
| Помет | 0,5-1,0 г | Стерильной деревянной палочкой. Поместить в 5,0 мл среды накопления. | В одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР |
| Тонкий кишечник | 1,0-2,0 г | Забирают стерильно участок в месте перехода тонкой кишки в толстую с содержимым. Поместить в 5,0 мл среды накопления. | В одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР |
| Брыжейка, мезентериальные лимфоузлы | 1,0-2,0 г | Стерильно измельчить, 1 мл суспензии поместить в 5,0 мл среды накопления | В одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР |
| Материал из внешней среды | |||
| Пищевые продукты[1] | 25 г | Измельчить, поместить в среду накопления в соотношении 1:10, для посева использовать надосадочную жидкость. | В одноразовый контейнер ложечкой, прилагаемой к контейнеру |
| Овощи | 10 штук каждого вида | Смыв одним влажным стерильным тампоном с поверхностей на границе здоровой и загнивающей части. Тампон поместить в 5,0 мл среды накопления | Тампон помещают в одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР |
| Смывы с оборудования, инвентаря, тары | 10 одноименных поверхностей | Одним влажным стерильным тампоном с поверхностей площадью 1002 см каждая. Тампон поместить в 5,0 мл среды накопления | Тампон помещают в одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР |
| Гнезда грызунов | Примерно 10 г субстрата гнезд | Образец растереть в ступке с песком и фосфатно-буферным р-ром. 1,5 мл взвеси внести в 5 мл среды накопления | 1,5 мл взвеси в одноразовую пробирку с 5-7 мл ЗФР |
| Вода из емкостей для хранения, вода открытых водоемов | Профильтровать через 0,22 мкм бумажный фильтр 1-2 л воды | Фильтры поместить в среду накопления. | Фильтры поместить в одноразовые контейнеры с 5 мл ЗФР |
| Почва | 50-100 г | Помещают в среду накопления в соотношении 1:10, для посева использовать надосадочную жидкость. | В одноразовый контейнер ложечкой, прилагаемой к контейнеру с 5 мл ЗФР |
Таблица 5
Характеристика колоний иерсиний на плотных питательных средах
| Вид | Среда Эндо | Среда Хоттингера | СБТС | Примечание | |||
| 24 часа | 48 часов | 24 часа | 48 часов | 24 часа | 48 часов | ||
| Yersinia pseudotuberculosis | Колонии мелкие (росинчатые) круглые, выпуклые, блестящие, бесцветные | Колонии диаметром 0,1-0,2 мм, крупные, выпуклые, блестящие с ровными краями, бесцветные | Колонии диаметром 0,1-0,2 мм, голубовато-белые полупрозрачные с ровными краями, слизистые со слабоприподнятым центром (под микроскопом имеют вид пирамид или со сходящимися к центру гранями) | Колонии диаметром 0,2-0,5 мм, прозрачные с ровным краем. В полиморфной популяции – часть колоний бугристая с неровными фестончатыми краями | Колонии мелкие круглые, могут иметь слегка желтоватую окраску | Колонии диаметром 1 – 2 мм, голубовато-зеленоватые, с фестончатыми краями, выпуклые с приподнятым центром и суховатой матовой поверхностью на синем фоне среды | На СБТС через 48 ч колонии E. сoli – ярко-желтые, диаметром 2-3 мм, сочные, выпуклые; Sh. flexneri – желтые, диаметром 1-2 мм сочные, плоские |
| Yersinia enterocolitica | Такие же | Такие же, но с розоватым оттенком | Колонии диаметром 0,1-0,2 мм до 0,5 мм, круглые, выпуклые с ровным краем, полупрозрачные с голубоватым оттенком мягкой консистенции | Колонии диаметром 0,3-0,5 мм более выпуклые, с ровным краем, прозрачные | Колонии диаметром 2 – 4 мм, голубовато-зеленоватые, выпуклые, сухие, с матовым налетом | ||
Y. pseudotuberculosis отличаются от Y. enterocolitica по отношению к сахарозе и рамнозе.
Тесты расширенного биохимического ряда - ферментация ксилозы, сорбита, салицина и образование индола – позволяют определить биотип Y. enterocolitica.