Эта краска обычно отпускается готовой. Очень многое в успехе окрашивания определяет безупречное качество раствора краски, а последнее в высшей степени зависит от реакции воды.
Для приготовления рабочего раствора краски употребляется дважды дистиллированная вода. Обычно она имеет рН=5,4, т. е. слишком кисла, и даёт слабую, плохую окраску. Поэтому такую воду нужно подщелочить, прибавив к 2—3 л воды несколько капель 1-процентного раствора соды. Лучшим рН воды следует считать 6,8—6,9 (до 7,1). При более щелочной реакции воды мазки получаются более синими (даже эритроциты).
Практически пригодность воды к окраске определяют по растворению в ней гематоксилина. В 10 см3 дистиллированной воды (лучше всего в часовом стёклышке) кладут пинцетом несколько крупинок гематоксилина. Не ранее как через 1 минуту и не позже 5 минут вода должна окраситься в ясный слабофиолетовый цвет. Более раннее и интенсивное окрашивание указывает на сильно щелочную реакцию, более позднее — на кислую.
Если нет очень хорошего гематоксилина, то реакцию воды, подщелачиваемой раствором соды, можно определить, пользуясь в качестве индикатора нейтральной красной. В два химических стакана (или колбы Эрленмейера) наливают по 200 см3 дистиллированной воды и прибавляют 1 — 2 капли 1-процентного раствора нейтральной красной. При рН дистиллированной воды, равном 5,4—5,5, получается свекловично-красная (рубиновая) окраска. После этого в один из стаканов прибавляют по капле, тщательно размешивая, 1% раствор соды до появления слабого оранжевого оттенка (цвет лососины). Нельзя доводить воду до ясно оранжевого и, тем более, жёлтого цвета, так как в этом случае реакция будет сильно щелочной.
Более кропотливо пользоваться индикаторами Михаэлиса и менее точно — универсальным индикатором.
Лучше всего для получения нужной и стойкой реакции воды применять буферные растворы. Хорошими буферными растворами для этой цели будут фосфатные. Для них нужно иметь два исходных раствора:
1. Двуосновного фосфата натрия (Na2HP04. •2Н20)—17,814 г на 1 л (рН =8,302).
2. Одноосновного фосфата калия (КН2Р04) — 13,638 г на 1 л (рН =4,529).
Азур II — смесь в равных частях красок: азур I (диметилтиониохлорид) и метиленовой синьки. В постаревшем растворе исходной краски Гимза метиленовая синька часто плохо окрашивает цитоплазму лимфоцитов (нет чисто голубого цвета). Тогда необходимо добавить метиленовой синьки в исходный раствор краски.
Если к литру дистиллированной воды прибавить по 5 см3 того и другого раствора, то рН такой воды будет равен 6,813. Случайные колебания концентрации углекислоты в воздухе при таком способе не оказывают влияния на рН воды.
Перед окраской (ex tempore) к дистиллированной воде прибавляют исходный раствор краски Гимза из расчёта 1,0—1,5 капли краски на 1 см3 воды.
Рабочий раствор краски наливается пипеткой (осторожно!) на предметное стекло так, чтобы препарат (мазок крови) был полностью покрыт краской. Стёкла помещаются над широкой чашкой Петри на стеклянных палочках, соединённых резиновыми трубками попарно. Во избежание осадков, которые невозможно отмыть, можно стёкла укладывать мазками вниз, на стеклянные палочки, лежащие в чашке Петри, так, чтобы краска покрывала мазки полностью (способ академика Н. Д. Стражеско).
При первом способе на один мазок тратится 2,5— 3,0 см3 рабочего раствора краски.
Через 20—30 минут краску сливают, препараты промывают водопроводной чистой водой и высушивают на воздухе. Для окраски старой краской требуется меньше времени.
При окраске раствором Гимза хорошо дифференцируется структура ядра, несколько хуже — структура цитоплазмы, особенно нейтрофильная зернистость. Однако при очень умелом окрашивании и зернистость выявляется достаточно хорошо.
По этому методу плохо окрашиваются псевдоэозинофилы (палочкозернистые гранулоциты) крови сельскохозяйственных птиц.
Окрашенные краской Гимза ядра имеют красивый фиолетово-красный цвет (цвет вишни); нейтрофильная зернистость — розовато-фиолетовый; эозинофильная зернистость — розовый или красно-розовый; базофильная —цвета мальвы; азурофильная — красно-фиолетового цвета.
Цитоплазма лимфоцитов — голубая, моноцитов — от голубовато-серой до пепельно-серой.
Эритроциты — красновато-розового цвета, полихроматофилъные эритроциты — синеватые, базофильная пунктация эритроцитов — синяя.
Если нет хорошей готовой краски Гимза, то можно хорошо окрасить мазки по Н о х т у. Для окраски по Нохту приготовляется два раствора: 1) 1-промил-льный раствор азура II; 2) 1-промилльный раствор эозина. Перед приготовлением рабочего раствора краску нужно оттитровать. Для этого сначала берут на 3 см3 дистиллированной воды 4 капли раствора азура II и 3 капли раствора эозина (т. е. в отношении 4 : 3). Если окраска мазков неправильна, пробуют отношение 4 : 4, или 4 : 5, или 4 : 6, и т. д.
Достаточно интенсивное окрашивание получается, если на 1,5 см3 азура II берётся 1,0 см3 эозина и 6 см3 воды.
Модификация Паппенгейма (Май-Грюнвальд — Гимза)
При этом способе окраски предварительная фиксация мазка не нужна, так как первая краска — Май-Грюнвальд имеет растворителем метиловый спирт.
Метод окраски двухмоментный. Сперва мазок покрывают 2 см3 неразведённой краски
Май-Грюнвальд, представляющей собой раствор в метиловом спирте эозина и метиленовой синьки. Если нет готовой надёжной краски, то растворяют приготовленный фабричным способом сухой порошок Май-Грюнвальд: 1,0 г порошка на 100 см3 абсолютного метилового спирта и 50 см3 чистого глицерина. Хорошая краска получается и без глицерина.
Через 3 минуты к краске Май-Грюнвальд, находящейся на мазке, прибавляют 2 см3 дистиллированной воды и тщательно смешивают их продуванием или последовательным набиранием и выпусканием через тонко оттянутую пипетку. Когда, примерно через 1 минуту, мазок приобретает розовый оттенок, краску с препарата сливают и после этого, не высушивая, 10—12—15 минут красят мазок рабочим раствором краски Гимза, а затем промывают чистой водопроводной водой. Этот способ окраски удачно сочетает хорошее выявление зернистости клеток краской Май-Грюнвальд с чёткой окраской структуры ядра раствором Гимза.
Такая окраска особенно ценна для выявления псевдоэозинофилов (специальных гранулоцитов) куриной крови.
Результаты окраски: ядра красно-фиолетовые, цитоплазма лимфоцитов голубовато-синяя, азурофильная зернистость лимфоцитов пурпурно-красная, миелоидная азурофилия фиолетово-коричневая, так же как и центральная субстанция кровяных пластинок. Нейтрофильная зернистость коричневато-красная, до синевато-розовой; эозинофильная — от красно-оранжевой до кирпично-красного цвета; базофильная зернистость тёмного ультрамариново-фиолетового цвета (метахромазия); эритроциты медно-розовые; полихроматофильные эритроциты синеватые; базофильная пунктация эритроцитов (слабо выявляемая) синего цвета *.
В целом, мазки, окрашенные по этому способу, несколько богаче оттенками, чем при окраске раствором Гимза, но кажутся более тёмными, «мрачными».
Цветные таблицы картин крови выполнены с препаратов крови, окрашенных по Романовскому в модификации Паппенгейма, лучше всего диференцирующей структуру клеток.
Ускоренная окраска раствором Гимза (новая модификация)
Этот метод даёт хорошие результаты только в руках опытного исследователя. Преимущество — быстрота приготовления препарата, так как фиксация и окрашивание происходят одновременно.
Для работы необходимы капельницы ёмкостью в 30 см3, в которые наливается исходный раствор краски Гимза, разведённый пополам метиловым спиртом или чистейшим ацетоном. В хорошо закупоренной склянке этот раствор может сохраняться месяцами.
Окрашивание производится или в чашках со специальными перекладинками, или в обычных чашках Петри. На свежий мазок (не позднее 2-дневного!), высушенный на воздухе и не фиксированный, наливают из капельницы около 20 капель краски. Чтобы предохранить краску от испарения, чашка, в которой лежат препараты, закрывается стеклом.
Через 1/2 минуты — 1 минуту к краске на мазке приливают около 10 см3 подщелочённой дистиллированной воды (1—2 капли 1-процентного раствора щелочи на 50 см3 воды). Покачиванием чашечки хорошо перемешивают краску с подлитой водой. Через 10— 15 минут воду с краской сливают и мазок промывают водопроводной (недистиллированной!) водой.
В случае приготовления основного раствора с ацетоном особенно хорошо выявляется зернистость структура ядер кровяные пластинки.
• Описание цветов дано, с некоторыми небольшими изменением, по А. II. Крюкову.
Окраска крови и кровепаразитов по Г. Эпштейну
Фиксация метиловым спиртом
Готовят два раствора.
1-й: дистиллированной воды 100 см3; лимоннокислого лития — 1 г; толуидиновой голубой — 1г. После разведения профильтровать.
2-й: насыщенный водный раствор пикриновой кислоты.
Мазки красят 20—30 минут в первом растворе и, ополоснув в проточной воде, помещают на 1—2 секунды во второй раствор (пикриновой кислоты). Промывают (тщательно!) снова в водопроводной воде и после этого быстро обсушивают фильтровальной бумагой.
Окраска: эритроциты зелёные; ядра лейкоцитов фиолетово-синие; базофильная зернистость вишнёвая; эозинофильная зернистость изумрудно-зелёная; нейтрофильная зернистость серая; у кровепаразитов ядро красное, а цитоплазма синяя.
Окраска составом Лейшмана
На нефиксированный препарат налить 15—20 капель готового раствора краски Лейшмана (0,1 г порошка краски растворить в 10 см3 метилового спирта). Через 2,5—3 минуты прибавить 30 капель дестиллированной воды и красить ещё 5 минут. Промыть в течение 2—3 минут проточной водой и высушить на воздухе.
Специальные способы окраски и фиксации мазка