а) Получение и окраска толстой капли. На хорошо промытое (подщелочённой водой, затем спиртом с эфиром) предметное стекло наносят 2 крупные капли крови. Собственно, достаточно одной капли, но вторая служит «резервом» на случай неосторожного стирания одной капли, неудачи окраски и т. д. Каждая капля сейчас же, с помощью иглы, распределяется по стеклу ровным слоем — примерно в 1\4 - 1\2 мм толщины, чтобы получились пятна размером с десятикопеечную монету. Препараты тщательно высушиваются (в термостате при 37° или на солнце) в течение получаса.
После этого высохший препарат дважды окрашивают рабочим раствором Гимза (1 капля исходного спиртового раствора Гимза на 1 см3 дистиллированной воды).
Первое окрашивание длится около 3 минут после того, как в растворе краски появится красное облачко растворившегося гемоглобина. Затем один конец предметного стекла слегка приподнимают и старый раствор Гимза заменяют новым, приливая его очень осторожно с приподнятого конца препарата, в то время как прежний раствор краски с гемоглобином стекает с другого конца. Когда таким образом вся старая краска сменена новой, предметное стекло снова устанавливают горизонтально и продолжают докрашивание ещё 25 минут.
Значение метода состоит в том, что в толстой капле удается обнаружить таких паразитов крови, которые находятся в ней в небольших количествах. Быстро устанавливается наличие или отсутствие эозинофилов и производится их подсчет их подсчёт.
То же самое в отношении базофильных эритроцитов.
б) Оксидазная и пероксидазиая реакции лейкоцитов. Оксидазная реакция основана на возникновении индофеноловой голубой краски при воздействии окисляющих ферментов на анафтол и диметилпарафенилендиамин; в местах локализации оксидаз в клетке возникает синее окрашивание.
Техника реакции состоит в следующем:
1. Фиксация мазка в смеси из 1 части 40-процентного формальдегида и 9 частей 95-процентного спирта в продолжение нескольких секунд пли 40-процентного формальдегида и абсолютного алкоголя аа в продолжение 15—20 минут.
2. Окраска: а) 3 минуты слегка разведённым 1-процентным водным щелочным раствором анафтола (раствор приготовляется следующим образом: анафтол при нагревании в дестиллированной воде поднимается кверху и плавает в жидком виде; после введения в раствор кристалла едкой щёлочи анафтол растворяется в воде); б) не удаляя анафтола, на препарат наслаивают 1-процентный водный раствор диметилпарафенилендиамина. Через несколько минут зернистость лейкоцитов, содержащая оксидазу, становится темносиней. Докрашивается препарат сильно разведённым раствором фуксина Циля.
Пероксидазная реакция.
а) Окраска по Край-биш в модификации Грэма. Хорошо высохший мазок в течение 10—15 минут фиксировать жидкостью, состоящей из 1 части 40-процентного формалина и 9 частей 95-процентного спирта. После фиксации слегка промыть водой и покрыть раствором бензидина (приготовление: к 10 см3 40-процентного этилового спирта прибавляется несколько кристаллов бензидина +00,2 см3 3-процентной перекиси водорода). Окраска длится 5 минут. Затем смыть водой.
Места локализации пероксидаз окрашиваются сначала в сероватый, а затем в золотисто-коричневый цвет.
Последующее докрашивание — тионином, метиленовой синькой или краской Гимза.
б) Окраска по Сато. Воздушносухие мазки фиксируют в течение 30 секунд 1/2-процентным раствором медного купороса (CuS04) и затем окрашивают бензидином с перекисью водорода (рецепт приготовления — как в предыдущем методе). Через 2 минуты препарат осторожно промывают дистиллированной водой, на мазок наливают слой 1-процентного водного раствора сафранина, через 15—20 минут сафранин смывают водой и высушивают препарат на воздухе (избегать высушивания фильтровальной бумагой!).
Пероксидазо-положительные гранулы окрашиваются в темносиний цвет, ядра — в красно-жёлтый; эритроциты не окрашиваются.
Посредством оксидазной и пероксидазной реакций облегчается диференциация миэлоидных клеток от лимфоидных. Обе реакции дают аналогичные результаты, но оксидазная реакция более чувствительна.
Нейтрофилы и эозинофилы реагируют резко положительно, базофилы так же, но только на ранних стадиях развития. Зрелые формы оксидазо-отрицательны. Однако ряд авторов считает, что и зрелые базофилы оксидазо-положительны.
Лимфоциты дают безусловно отрицательную реакцию. Моноциты — иногда очень слабо положительную.
С клинической точки зрения представляет интерес тот факт, что при некоторых инфекционных заболеваниях у нейтрофилов исчезают положительная оксидазная п пероксидазная реакции.
в) Окраска токсической зернистости раствором Гимза при рН =5,4. Токсическую зернистость, в отличие от обычной, нормальной зернистости гетерофилов (нейтрофилов), избирательно окрашивают, при окраске по принципу Романовского раствором краски Гимза, применяя буферный раствор с рН =5,4.
Буферный раствор:
Едкий натр (химически чистый) . 21,6 г
Уксусная кислота (химически чистая) .............. 27,0 »
Дистиллированная вода до.....1000,0 см3
Приготовление краски:
Исходной краски Гимза …………10см3
Дистиллигрованной воды ……….40 »
Буферного раствора до ………….100 »
Свежие мазки окрашивают в продолжение 1 часа, старые препараты — дольше (до 2 часов). Краска с мазка смывается буферным раствором и затем высушивается, как обычно.
При окрашивании препарат нужно класть на раствор краски мазком вниз.
Белые кровяные тельца – лейкоциты.
Лейкоциты (белые кровяные тельца) различаются между собой как морфологически, так и по биологической роли в организме. Будучи полноценными клетками, имеющими протоплазму и ядро, лейкоциты обладают отчётливо выраженной способностью к активному способу питания путём захвата и внутриклеточного переваривания попадающих в кровь органических тел. Эта способность приобретает первостепенное биологическое значение в случае проникновения в организм патогенных микробов: пожирание их лейкоцитами — фагоцитоз (Мечников, 1882—1893) — составляет важнейшее средство борьбы организма с инфекцией.
Наряду с фагоцитозом, весьма важное значение имеет образование лейкоцитами иммунных тел. У многих низших, а весьма возможно и высших животных особые лейкоциты выполняют также функцию переноса питательных веществ (трефоциты). Наконец, отдельные виды лейкоцитов (эозинофилы высших животных) способны обезвреживать токсины. Крупную роль лейкоциты играют в обмене веществ и в образовании так называемых трефонов — стимуляторов клеточного роста, особенно в условиях регенерации тканей.
Структурные различия отдельных видов белых кровяных телец изучены, начиная с работ П. Эрлиха (Р. Ehrlich, 1877—1898 гг.), достаточно хорошо. Значительно менее изучены их функциональные особенности, их целлюлярная физиология. Несмотря на огромное количество работ, онтогенез белой крови полностью ещё не выяснен. Наконец, сложная нейро-гуморальная регуляция сосудистой и внесосудистой белой крови исследована в чрезвычайно малой степени. Мало данных имеется даже о длительности жизни белых кровяных телец. По некоторым авторам, она весьма невелика (3—4 дня).
Основным принципом современной классификации лейкоцитов является морфологический.
У различных сельскохозяйственных и лабораторных животных один и тот же тип лейкоцитов (особенно эозинофилы и нейтрофилы, или гетерофилы) имеет специфические отличия в структуре. Однако в главном структура каждого типа лейкоцитов у всех сельскохозяйственных животных весьма близка и поэтому целесообразно вначале дать их общее описание, без видовой дифференциации.
По структуре ядро эозинофилов близко к ядру нейтрофилов, но несколько бледнее и выглядит грубее, так как чередующиеся светлые (оксихроматин) и тёмные (базихроматин) участки ядра эозинофилов крупнее, чем у нейтрофилов.
По мере созревания клетки ядро эозинофильных лейкоцитов изменяется в том же направлении, что и нейтрофильных, т. е. ядерный жгут скручивается и утончается, сперва равномерно (юные и палочкоядерные формы),а затем отдельные участки (сегменты) почти перестают утончаться и остаются сравнительно толстыми, а находящиеся между ними — превращаются в "тончайшие нити (сегментоядерные формы). Однако сегментация ядра эозинофилов выражена не очень резко. Очень частой, типичной формой является 2-дольчатая форма ядра, причём дольки напоминают формирующиеся и только что отрывающиеся капли, обращенные друг к другу узкими концами, соединёнными перемычкой, или две груши, соединённые плодоножками. У овец полиморфность ядра эозинофилов выражена сильнее. Хотя при некоторых болезнях можно наблюдать в крови изменение отношения между возрастными формами эозинофилов в сторону увеличения более молодых (палочкоядерных, юных и даже миэлоцитов. — «сдвиг ядра влево»), но, ввиду относительной малочисленности (3—10%) эозинофилов, учёт ядерного сдвига в лейкоцитарной формуле не производится.
Эозинофилы имеют очень большое клиническое значение. Эозинофилы или исчезают из крови (анэо-винофилия), или уменьшаются в количестве (гипоэозинофилия), или, наконец, количество их резко нарастает (гиперэозинофилия, или просто эозинофилия). Большинство инфекционных заболеваний в первом своём периоде связано с резким уменьшением количества эозинофилов (гипоэозинофилия). Возврат эозинофилов в кровяное русло считают признаком ослабления болезни. При роже свиней и при многих инвазиях (особенно гельминтозах) наблюдается резкое увеличение эозинофилов (эозинофилия), доходящее у крупного рогатого скота до 40%. Эозинофилия встречается и при аллергических реакциях, причём здесь её связывают, так же как и при гельминтозах, с раздражением системы блуждающего нерва.
Функции эозинофилов недостаточно изучены.
Вероятна способность их зернистости к обезвреживанию токсинов, а также участие зёрен в окислительных процессах. Эозинофилы скопляются в местах тканевой регенерации. Характерна локальная эовинофилия кишечника.