Первое врёмя представитель высшей власти в крае, генерал-губернатор граф А. Г. Строга-нов, относился к деятельности Пирогова спокойно. Но, когда попечитель передал газету профессорам, генерал-губернатор насторожился. Программная статья самою Пирогова не понравилась графу Строганову. Начальник учебного округа заявлял в «Одесским вестнике», что газета должна прислушиваться к мнению публики. Пирогов писал о необходимости равноправия для всего многонационального населения Новороссии: " Вспомните, что «Одесский вестник» может попасть в руки и великорусса, и малороссиянина, и молдавана, и грека, и еврея». Нельзя также потакать низменным вкусам толпы или проявлять национальный шовинизм: «истинный талант и истинное искусство привлекает, не спускаясь».
Генерал-губернатор не выдержал Он завёл с Петербургом переписку о необходимости отобрать газету из рук Пирогова и его ставленников. Графу Строганову энергично содействовали губернский предводитель дворянства и другие лица, посылавшие в министерство жалобы на «развращающее» влияние газеты.
Царь велел уволить Пирогова. Либеральным придворным кругам удалось в июле 1858 года. добиться перевода Николая Ивановича попечителем в Киев «Язык до Киева доведёт»,— оставил по этому поводу генерал-губернатор.
Деятельность Пирогова в Одессе имела большое значение и для развития высшего образования в Новороссии. Благодаря его настоятельным указаниям был учреждён в Одессе университет, остававшийся до самой Великой Октябрьской социалистической революции единственным высшим учебным заведением в крае.
В Киеве Пирогов продолжал свою прежнюю педагогическую деятельность. Статьями в общих журналах и в основанных им печатных «Циркулярах» по округу Николай Иванович, как и в Одессе, «вечевым колоколом будил спящих» (слова современника).
Много внимания уделял попечитель развитию в педагогах духа коллегиальности. Предлагал обсуждать на общих собраниях педагогических советов новые методы преподавания. Устраивал литературные беседы в средней школе. Содействовал открытию воскресных и вечерних школ для взрослых. Заботился о насаждении среди учащихся любви к искусству. Защищал студентов от придирок полиции. Поощрял открытие газет и журналов для национальных меньшинств. Облегчил положение подцензурной печати. Предложил министерству освободить студентов-медиков от обязательного посещения лекций по богословию. Ввёл в школьные программы преподавание основных начал гигиены. Требовал исследования учащихся в психофизическом отношении, указывая, что леность, рассеянность, невнимательность зависят не от злой воли детей, а от строения их организма, от состояния здоровья школьников.
Пирогов сам заявлял впоследствии, что в должности попечителя округа он старался быть миссионером просвещения. Он «преимущественно заботился, — пишет один исследоватёль, —о соглашении школы с жизнью, о возбуждении в учащих и учащихся уважения к человеческому достоинству и истине».
В этот период своей деятельности Пирогов стремился сглаживать шероховатости межнациональных отношений, обращался к учащимся избегать резкостей, не раздражать начальства, т. е. жандармов и генерал-губернатора, проявлять такт и т. п. Здесь еще больше отразился либерализм политических взглядов Пирогова.
В Киеве были написаны, или продуманы, основные труды Николая Ивановича о высшем образовании. Намеченные Пироговым пути университетской реформы были для того времени недостижимым идеалом. Только значительно позднее требования и пожелания Пирогова в области высшей школы стали постепенно и частично проводиться в жизнь.
Просветительная деятельность Пирогова не нравилась киевскому генерал-губернатору так же, как одесскому. В первом своём всеподданнейшем отчёте после перевода Николая Ивановича в Киёв генерал-губернатор князь И. И. Васильчиков писал, что «киевские студенты требуют особенного за собою наблюдения: между ними заметен дух вольнодумства и стремление заводить порядки, не чуждые патриотических замыслов; в учениках гимназии тоже заметны вольнодумство и легкомыслие; к сожалению, попечителем учебного округа, в целях развития в учащихся понятия о чести и добре, примяты меры, которые могут питать вредное направление молодёжи.
В конце 1859 года состоялось в Петербурге совещание попечителей учебных округов по вопросу о предотвращении студенческих волнений. Придворные либеральные круги воспользовались приездом Пирогова в столицу, чтобы снова выдвинуть его на руководящий пост в министерстве просвещения. Николая Ивановича уверяли, что при известных условиях государь согласится на это. Пирогова просили только не говорить резко в присутствии императора.
В семейном архиве Пирогова сохранилось два его письма к жене об этих переговорах и свидании его с царём в декабре 1859 года. «Великая княгиня уже намекала мне о товариществе по министерству народного просвещения, но я решительно отказал. Избавил бог теперь. Она говорит: главное, нужно получить доверие государя. Я знаю, что это — главное; да в этом-то и штука, что его или не получишь, или, если и получишь, го не так, как бы нужно было. В первых числах января я отсюда уеду, что бы там ни толковали, я уж об этом объявил министру».
От поста товарища министра Пирогов отказался потому, что не считал возможным участвовать в рядах правительства, подчинявшегося влияниям крепостнических придворных кругов. Он не считал возможным «исказить свой образ действий для того только, чтобы утешать себя обманчивою тишиною. пассивным безмолвием и кажущимся порядком».
В следующем письме Николай Иванович сообщает: «Представлялся государю и великому князю. Государь позвал ещё и Зиновьева и толковал с нами целых 3/4 часа; я ему лил чистую воду. Зиновьев начал благодарением за сделанный им выговор студентам во время его проезда через Харьков,— не стыдясь при мне сказать, что это подействовало благотворно. Жаль, что аудиенция не длилась ещё 1/4 часа; я бы тогда успел высказать всё, — помогло ли бы, нет ли,— по крайней мере с плеч долой».
Незачем было отказываться. Всё равно царь не согласился бы назначить Пирогова товарищем министра. Князь Васильчиков продолжал жаловаться на попечителя. Он писал царю, что по вине Пирогова киевская молодёжь совсем распущена: ученики гимназии не застёгивают мундиры на все пуговицы, учителя отпускают усы, студенты разговаривают с попечителем запросто.
Перечисляя «вредные» мероприятия попечителя, генерал-губернатор сообщал в Петербург, что Пирогов предлагает устроить учительские семинарии для подготовки исключительно из крестьян преподавателей сельских школ. Попечитель утверждает, что лучшим учителем крестьян может быть крестьянин, знакомый с потребностями сельчан, с их бытом и нуждами. В это дело вмешалась высшая церковная власть. Синод заявил, что обучение крестьян должно оставаться в руках духовенства. Только духовное лицо может при обучении «простого человека указать ему способы употребления столь опасного оружия».
Царь разделял возмущение' синода просветительными планами Пирогова. Он высказывал это даже за обедом своим приближённым. Один из них, Павел Муханов, сообщил в письме к брату: «Государь вовсе не одобряет проект Пирогова о всяческом облегчении доступа в университет, так чтобы все желающие в него вступить, даже и крестьяне, не подвергались экзамену. Государь сказал, что тогда будет столько же университетов, сколько и кабаков». Для царя кабаки были важнее университетов.
Васильчиков требовал от царя, чтобы из Киева убрали Пирогова, иначе генерал-губернатор угрожал своей отставкой. Он писал о крамольности педагогических взглядов попечителя, о его попустительстве революционной пропаганде во всех учебных заведениях округа.
Друзья писали Николаю Ивановичу из Петербурга, что дело его совершенно проиграно при дворе. Ему советовали подать царю заявление о желании уйти с поста попечителя. Обещали устроить почётное положение с большим окладом. Николай Иванович и сам видел, что оставить должность попечителя надо, но посылать царю заявление не хотел. «Наконец, осуществилось то, что я предчувствовал в течение пяти лет,— писал он своим придворным друзьям.— Министр дал мне знать, что сильная интрига очернила меня и что он не уверен в том, что ему удастся защитить меня и мой образ действий... Мне советуют принять другое назначение и немедленно редактировать в этом смысле моё прощение об отставке, чего я, конечно, не сделаю. Зачем я стану упорствовать в моих попытках быть полезным отечеству моею службой? Разве они не убедили меня в том, что во мне нехватает чего-то, чем необходимо обладать, чтобы быть приятным и казаться полезным. Я могу сказать, положа руку на сердце, что, вступив на скользкий путь попечителя округа, я старался всеми силами и со всею, свойственной моей душе энергией, оправдать пред своим отечеством высокое доверие, мне оказанное... Я не довершил ни одного проступка, которого не мог бы оправдать пред судом своей совести. Больше этого я не мог сделать».
Это было извинение перед своими придворными либеральными друзьями, которые так много заботились о нем.
Придворные друзья всё-таки пытались отстоять Пирогова. Это можно видеть из другого его письма: «Я не делаю и не сделаю первого шага, потому что я считаю такой образ действий слабостью. Я потому буду спокойно ждать, пока со мною простятся или меня заставят проститься. Я покоряюсь судьбе и тем утешен, что имею между моими друзьями очень мало глупцов, а между врагами — много слабоумных».
После манифеста, 19 февраля 1861 года о так называемом освобождении крестьян Александр II стал увольнять своих либеральствующих министров. 15 марта 1861 года он подписал указ об увольнении Пирогова от должности попечителя, Другого назначения Николай Иванович не получил.