изменению интенсивности дыхания с помощью радиоактивной метки
14
( С) и по изменению продукции фотосинтеза под влиянием вещества
(A - Z-тест по Кнеппу).
Приготовление проб для биотестирования, подготовка к эксперименту, проведение основного эксперимента, эксперимента с радиоактивной меткой и A - Z-теста по Кнеппу изложены в [30].
11.2.2. Анализ результатов. В различные интервалы времени - через 1 сут., 3 сут. и так далее (время эксперимента определяют опытным путем в зависимости от токсичности испытуемых веществ: от 1 сут. до 30 сут.) в опытных и контрольных колбах определяют плотность культуры водорослей. Уменьшение или увеличение числа клеток водорослей выражают в процентах от контроля.
14
Подсчет импульсов мечения углерода ( C) проводят с помощью
жидкостного сцинтилляционного спектрометра любой марки, пригодного
для обнаружения источников бета-излучений. Показания спектрометра,
полученные для трех параллельных проб, усредняют и соотносят к
показаниям контроля (100%). Ингибирование или стимулирование
дыхания водорослей выражают в процентах от контроля.
Концентрация вещества, ингибирующего дыхание водорослей более
чем на 15%, считается токсичной для фитогидробионтов.
Расчет A - Z-тест-показателя проводится по формуле:
(O - O ) - (O - O )
хв х кв к
X = 100 x ----------------------- %,
(O - O )
кв к
где:
X - изменение продукции фотосинтеза под влиянием вещества, %;
(O - O ) - разница между количеством кислорода в опытных
хв х
склянках, с водорослями и без водорослей, через 24 ч;
(O - O ) - разница между количеством кислорода в контрольных
кв к
склянках с водорослями и без водорослей, через 24 ч.
X может быть как положительным, так и отрицательным (при ингибировании фотосинтеза под влиянием вещества). Концентрация вещества, ингибирующая фотосинтез более чем на 15%, считается токсичной для фитогидробионтов.
11.3. Биотестирование на хлоропластах высшего водного растения ряски Lemna minor
11.3.1. Сущность метода. Метод основывается на оценке изменения под действием токсикантов состояния пигментного комплекса хлоропластов, изменения их фототаксиса (движения хлоропластов по отношению к источнику света). Подсчет хлоропластов с отрицательным фототаксисом проводят под бинокулярным микроскопом при увеличении 10 x 10.
Подготовка и проведение эксперимента описаны в [30].
11.3.2. Анализ результатов. Процент эпистрофных хлоропластов после 10-минутного воздействия сильного света по отношению к исходному уровню служит показателем повреждения мембран хлоропластов токсикантом.
Достоверность отличия контрольных показателей и опытных вычисляют по критерию t Стьюдента.
11.4. Биотестирование на зоогидробионтах, на ветвистоусых рачках дафниях Daphnia magna
11.4.1. Сущность метода. При биотестировании используют основной метод: кратковременные опыты - 1 - 2 сут., 5 - 7 сут.; дополнительный метод - субхронический опыт - 14 сут.; специфический метод - хронический опыт - 21 - 30 сут. При этом оценивают поведение рачков, их рост, число линек, степень наполнения кишечника, время образования и развития яиц, число пометов, количество народившейся молоди.
Наиболее показателен тест выживаемости рачков, темп размножения, анализ плодовитости и роста потомства. По этим параметрам определяют LT50, LC0, LC50, LC100.
Подготовка и проведение кратковременного эксперимента (острый - 96 ч, подострый - 5 - 7 сут., субхронический - 14 сут.) и хронического эксперимента (21 - 30 сут.) описаны в [30].
11.4.2. Анализ результатов. В остром, подостром и субхроническом эксперименте изменение жизнедеятельности дафний в опыте сравнивают с контролем.
По результатам кратковременных опытов определяют:
LT50 - среднее (медианное) время выживания 50% особей в ряду концентраций;
LC0 (96 ч) - пороговая концентрация (максимальная недействующая), при которой организмы не гибнут в течение 96 ч наблюдения;
LС50 (96 ч)(14 сут.) - средняя (медианная) летальная концентрация, вызывающая гибель 50% подопытных рачков в течение 96 ч или 14 сут.;
LC100 (96 ч)(14 сут.) - концентрация вещества, при которой гибнут все животные в течение определенного срока наблюдения (96 ч или 14 сут.).
По характеру и интенсивности действия веществ обычно выделяются следующие группы концентраций:
а) концентрации, оказывающие остролетальное действие, т.е. приводящие к массовой гибели организмов за сравнительно короткие сроки (1 - 2 сут.);
б) концентрации, оказывающие хроническое летальное действие или гибель всех или большинства организмов за длительные сроки (до 30 сут.);
в) концентрации, оказывающие сублетальное (угнетающее) действие, не приводящие к гибели организмов;
г) концентрации, оказывающие стимулирующее действие, сопровождающееся или не сопровождающееся патологическими явлениями;
д) недействующие концентрации.
Пограничную концентрацию находят между группами "в" и "г", если стимуляция явно не связана с патологией, и между группами "г" и "д" в остальных случаях.
Для определения LC50 используют метод пробитов.
В хроническом эксперименте для определения безвредных концентраций для дафний результаты опытов приводят в следующей форме:
- выживаемость в процентах в течение 21 - 30 сут.;
- плодовитость - количество молоди за 21 - 30 сут. в пересчете на 1 особь в процентах к контролю;
- размеры дафний в процентах к контролю и к размерам исходной генерации.
Следует так же, как в кратковременных экспериментах, определить LC0; LC50; LC100; LT50, используя пробит-анализ.
Обработка результатов биотестирования для оценки хронического токсического действия на дафний проводится в соответствии с ГОСТом 8.207-76.
Вывод о наличии или отсутствии хронического токсического действия ЛС на дафний делается на основании расчета достоверности разности между показателями общей численности дафний после 21 - 30 сут. экспозиции в контрольных и тестируемых пробах.
В ряде случаев биотестирование на дафниях позволяет выявить некоторые специфические токсические свойства веществ. Так, стойкое нарушение генеративной функции у дафний при тестировании ЛС позволяет прогнозировать нарушение репродуктивной функции и/или эмбриотропное действие у млекопитающих.
11.5. Биотестирование на инфузориях Tetrahymena pyriformis
Тетрахимена распространена в пресных водах с высоким содержанием органического вещества, в неочищенных сточных водах. Встречается в сооружениях биологической очистки, в активном иле.
11.5.1. Сущность метода. Метод основан на реакции инфузорий на появление в среде токсических веществ. Критериями токсического действия являются выживаемость, изменение плотности культуры, репродукция.
Оценка токсичности производится по результатам острого и хронического действия испытуемого вещества на инфузории.
За острую токсичность принимается действие тестируемого вещества на инфузории в течение 6 ч. Показателем токсичности является достоверное различие в количестве выживших инфузорий в тестируемом веществе по сравнению с контролем.
За хроническую токсичность принимается действие тестируемого раствора вещества в течение 48 ч. Показателем токсичности является достоверное снижение количества клеток в тестируемом растворе вещества по сравнению с контролем.
Дополнительный метод включает определение токсикологических параметров LC50, LC100, LT50, а также расчет темпа размножения инфузорий.
Способ лабораторного содержания тетрахимен, проверка чувствительности культуры инфузорий к токсикантам, метрологическая характеристика методики, подготовка к эксперименту, проведение эксперимента с массовой культурой и капельным методом описаны в [30].
11.5.2. Анализ результатов. В опыте с массовой культурой достоверность разности количества инфузорий в опыте и контроле определяют с помощью критерия t Стьюдента.
Для оценки результатов капельного метода в ходе эксперимента регистрируют погибшие особи, отмечают морфологические изменения и поведение инфузорий. Вычисляют процент летальности инфузорий через различные интервалы времени (1 ч, 3 ч, 6 ч, 18 ч, 24 ч). Рассчитывают LT50; LC0; LC50; LC100.
Статистическую обработку проводят с использованием критерия t Стьюдента.
Рост генерации (темп размножения - n) вычисляют по формуле:
ln N - ln N
t 0
n = -------------,
ln2
где:
N - число инфузорий в конце опыта;
t
N - число инфузорий в начале опыта.
0
11.6. Биотестирование на плоских червях турбелляриях, планариях Dugesia lugubris
11.6.1. Сущность метода. Метод основан на оценке реакции планарий при присутствии в среде токсических веществ. По своей токсикологической характеристике планарии относятся к устойчивым (токсобным) гидробионтам, но действие сильных токсикантов вызывает реакцию избегания отравленной среды, паралич двигательной активности и деструкцию тела, которая обычно начинается с головного конца.
Критериями токсического действия являются выживаемость, поведение, морфологические параметры планарий.
В специальном эксперименте изучают темп регенерации головного конца планарий после резекции.
Подготовка к эксперименту и его проведение описаны в [30].
11.6.2. Анализ результатов. Проводят учет и регистрацию морфологического и физиологического состояния планарий: частичная или полная остановка движения, обильное выделение слизи, деструкция и лизис тканей.
Расчет летальности выражают в процентах гибели особей. Полученные данные соотносят с контролем. Вычисляют LC50 по результатам пробит-анализа. Вещества, обладающие раздражающим действием, вызывают реакцию избегания среды с токсикантом.
При проведении специального эксперимента прирост бластемы измеряют в микрометрах. Достоверность различий контрольных и опытных значений определяют по критерию t Стьюдента. Замедление темпа регенерации бластемы под влиянием ЛС позволяет сделать вывод о специфическом цитостатическом действии вещества и прогнозировать аналогичное действие у млекопитающих.