2.2.2. Установление порога острого действия. Для планирования исследований ингаляционной токсичности ЛС могут использоваться уравнения, полученные при анализе связей между порогами острого действия при ингаляционном воздействии (в мг/куб. м) и ЛД50 при внутрибрюшинном и пероральном поступлении:
lg Lim = 0,7lg ЛД50 в/бр + 0,06; (7)
ac
lg Lim = 0,91lg ЛД50 в/ж - 0,63; (8)
ac
lg Lim = 0,72lg Lim в/бр + 0,05; (9)
ac ac
lg Lim = 1,02lg Lim в/ж + 0,10. (10)
ac ac
Исследования, как правило, проводятся при ингаляционном пути поступления. При сравнительном изучении ЛС, сходных по своей фармакологической активности с ранее нормированными в воздухе рабочей зоны препаратами, допустимо использование перорального или парентерального пути введения.
Условия проведения экспериментов должны соответствовать действующим нормативно-методическим указаниям [24, 25, 26, 44, 45]. При выборе адекватных методов и тестов для токсикологического исследования и обоснования пороговых уровней целесообразно учитывать особенности нормирования ЛС (раздел 1.2). При этом необходимо различать методы интегральные, отражающие общетоксическое действие на органы и системы, и специфические методы, обусловленные фармакологическим и побочным действием ЛС.
Вместе с тем при исследовании ЛС разделение методов на интегральные и специфические весьма условно. В каждом отдельном случае интегральный показатель может перейти в разряд специфических, например масса тела при изучении анаболиков и некоторых психотропных ЛС; уровень ректальной температуры при исследовании психотропных, тиреотропных и йодсодержащих средств и т.д. является специфическим показателем. Важно в пределах доступного, но не в ущерб ценности обоснования того или иного токсикологического параметра, оценить функциональное состояние органов и систем с использованием адекватных патогенетических обусловленных методов.
Оценку состояния организма подопытных животных необходимо
проводить в динамике. Оценка интегральных и специфических
показателей позволяет установить Lim , Lim и Z . Далее в
ac ac pharm sp
расчетных уравнениях для простоты написания используется
обозначение только Lim .
ac
КонсультантПлюс: примечание.
Нумерация пунктов дана в соответствии с официальным текстом документа.
2.2.2.3. При выборе уровня острого ингаляционного воздействия следует ориентироваться на величину МСТД для человека (в г):
lg Lim = 0,65lg МСТД + 1,75. (11)
ac
Если на уровне концентрации 100 мг/куб. м изменения у подопытных животных не выявляются, то испытание более высоких концентраций аэрозоля ЛС нецелесообразно [29].
2.2.2.4. Исследования пульмонотоксического и фиброгенного действия осуществляется в соответствии с принципами и методами, изложенными в [28]. В частности, эти исследования необходимы при изучении субстанций ЛС и сложных лекарственных форм, содержащих металлы и минеральные компоненты.
2.2.2.5. Оценку состояния организма подопытных животных необходимо проводить в динамике с учетом скорости и стойкости реакции. При наличии данных о токсико/фармакокинетике ЛС или его метаболита обследование животных целесообразно проводить в момент соответствующей максимальной концентрации химического соединения в исследуемом биосубстрате, а также в период снижения концентрации в 2 раза. Общие подходы к оценке зависимости биологического эффекта от содержания исследуемого вещества в биосубстратах изложены в методических рекомендациях [42].
2.2.2.6. Для выявления избирательности фармакологического действия ЛС и установления порогового эффекта рекомендуется использование методических приемов с применением известных фармакологических веществ в качестве нагрузок, перечень которых для основных групп ЛС (психотропные, сердечно-сосудистые и др.) представлен в Приложениях 3 и 4. Влияние указанных фармакологических веществ на центральную нервную систему (снотворные, стимуляторы медиаторных процессов, катехоламины и др.), сердечно-сосудистую и другие регуляторные системы широко используется в фармакологическом скрининге [3, 10, 16, 17].
Критериями оценки для выявления фармакологических и/или патогенетических эффектов при применении нагрузочных тестов могут служить количественная оценка поведенческих и вегетативных проявлений по степени их выраженности, продолжительность и скорость восстановления в сравнении с реакцией контрольных животных на идентичное воздействие.
ЛС, используемые в качестве нагрузок, вводятся, как правило, в опытах на мышах и крысах внутрибрюшинно за 45 мин. до основного эксперимента с последующей регистрацией длительности и выраженности вызываемых эффектов: гексеналовый сон (80 - 100 мг/кг); апоморфиновая и фенаминовая стереотипия (2 и 6 мг/кг соответственно); резерпиновый птоз и гипотермия (2 мг/кг); ареколиновый гиперкинез (25 мг/кг); никотиновый тремор (7 мг/кг); длительность жизни и наличие судорог у животных, получивших коразол (150 мг/кг); наличие судорог и гибель животных после максимального электрошока (50 мВ; 0,2 с, 50 Гц) по методу Суинъярда.
В случае взаимодействия с резерпином последний вводится за 4 часа до эксперимента, затем животные получают испытуемое вещество и через 45 минут оценивают изменение температуры, птоз и снижение двигательной активности [3, 18]. Так, например, наиболее важные для группы нейролептиков эффекты - каталепсия, блокада апоморфиновой и фенаминовой стереотипии, гипотермия обусловлены их основным дофаминоблокирующим действием на молекулярном уровне и характеризуют антипсихотические свойства.
Несмотря на кажущуюся простоту набора тестов, они четко отражают основной механизм и характерный спектр действия фармакологических групп веществ, перечисленных в Приложениях 3 и 4, и позволяют получить информацию о характере испытуемого вещества, установить пороговые дозы и концентрации по влиянию на широкий спектр психотропной, противосудорожной и других видов активности, включая центральные нейромедиаторные системы (норадренергическую, холинергическую, дофаминергическую, серотонинергическую и ГАМК-эргическую).
Рекомендуемые модели фармакологических нагрузок могут быть использованы как при однократных, так и повторных воздействиях при условии выведения этих групп животных из последующего эксперимента.
2.2.3. Изучение кумулятивных свойств и особенностей биологического действия ЛС в подостром эксперименте. Для оценки кумулятивного действия по летальному эффекту рекомендуется использовать общепринятые в практике промышленной токсикологии тест субхронической токсичности Лима и соавт. в модификации К.К. Сидорова и метод Ю.С. Кагана и В.В. Станкевича с ежедневным введением 1/10 ЛД50. При необходимости специального изучения кумулятивных свойств вещества, в зависимости от величины вводимой дозы, желательно проведение эксперимента с введением крысам 2 - 3-х доз исследуемого ЛС (1/5 - 1/50 ЛД50) [49].
2.2.4. Изучение сенсибилизирующего и иммунотоксического действия ЛС. Оценка сенсибилизирующего действия ЛС осуществляется в соответствии с требованиями к постановке исследований по обоснованию предельно допустимых концентраций промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы [41] и рекомендациями по оценке аллергенных свойств фармакологических средств.
Поскольку в естественных условиях чаще наблюдается комбинированная сенсибилизация по сравнению с селективной формой, для более полной характеристики аллергенной активности ЛС рекомендуется проведение дополнительных исследований:
- активной и пассивной кожной анафилаксии;
- дегрануляции тучных клеток;
- специфического торможения миграции макрофагов;
- секреции гистамина из клеток-мишеней (тучные клетки, базофилы);
- титра комплемента в сыворотке крови по 50% гемолизу;
- циркулирующих иммунных комплексов в тканях и сыворотке крови.
При исследовании ЛС, обладающих иммуномодулирующим действием, а также соединений, которые по своему химическому строению сходны с веществами, способными активно реагировать с молекулярными структурами и клеточными элементами иммунной системы, проводится оценка их иммунотоксических свойств. При проведении исследований необходимо руководствоваться методическими рекомендациями по экспериментальному изучению иммунотоксических свойств химических факторов окружающей среды [48].
Кроме того, рекомендуется руководствоваться положениями, изложенными в методических материалах по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств и методических рекомендациях по оценке иммунотоксических свойств фармакологических средств.
Существенную помощь в решении вопроса о необходимости определения порога иммунотоксической активности можно получить из литературных сведений о ЛС и его аналогах, а также на основании данных визуального патоморфологического обследования органов иммуногенеза (селезенка, лимфоузлы, тимус), показателей лейкограммы (процентное и абсолютное содержание лимфоцитов, лейкоцитов, анализ лейкоформулы) экспериментальных животных в хроническом опыте при определении кумулятивных свойств лекарств и определении сенсибилизирующей активности.
Установление пороговой и подпороговой концентрации ЛС при ингаляционном воздействии осуществляется в подостром месячном эксперименте в условиях затравки животных 5 раз в неделю по 4 часа. Обследование животных проводят на 1, 2 и 4 неделе с момента эксперимента. Целесообразно изучение обратимости наблюдаемых изменений в восстановительном периоде после прекращения затравки.
Модуляцию клеточного иммунитета оценивают по относительному и абсолютному числу Т-лимфоцитов, выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа - ГЗТ, реакции "трансплантат против хозяина" - РТПХ и др. Оценку выраженности антителогенеза осуществляют путем определения абсолютного и относительного числа В-лимфоцитов, антителообразующих клеток селезенки (АОК) и агглютининов к эритроцитам барана.