2. Определение рН молока
Реакция среды кислая или близка к нейтральной: рН= 6,5-7,0
Ход работы.
Самый простой способ определения – с помощью индикаторной бумажки. На индикаторную (лучше универсальную) бумажку наносят несколько капель молока и определяют рН.
3. Определение белков молока
Осаждение казеина
Молоко разбавляют в 5 раз (в стакан или колбочку на 100 мл приливают 10 мл молока и 40 мл дистиллированной воды), после чего прибавляют по каплям (постоянно помешивая палочкой) 0,1%-й раствор уксусной кислоты до прекращения образования хлопьевидного осадка казеина, осаждающего и жир.
Примечание. Прибавлять кислоту следует осторожно, так как при ее избытке казеин растворяется.
Осадок отфильтровывают. Полученный при этом фильтрат (№ 1) используют для определения в нем всех остальных белков, содержащихся в молоке, а осадок промывают несколько раз дистиллированной водой и с помощью биуретовой реакции доказывают наличие белка казеина в нем.
Выделение альбумина
К 25 мл фильтрата № 1 прибавляют 2 мл 10%-го раствора аммиака, насыщают порошком сернокислого магния, помутнение раствора при этом указывает на присутствие глобулина. Образовавшийся осадок отфильтровывают, полученный фильтрат № 2 используют для выделения альбумина, а осадок промывают дистиллированной водой и с помощью цветных реакций доказывают присутствие в нем белка глобулина.
Выделение глобулинов
Фильтрат № 2 слегка подкисляют 10%-м раствором уксусной кислоты и нагревают до кипения. Выпавший осадок лактоальбумина отфильтровывают; полученный при этом фильтрат № 3 используют для определения лактозы, а осадок, оставшийся на фильтре, промывают дистиллированной водой и с помощью цветных реакций доказывают присутствие белка лактоальбумина в нем.
4. Определение лактозы в молоке (реакция Фелинга)
К 2-3 мл фильтрата № 3 прибавляют 1-2 мл 10%-го раствора едкого натра, 0,5-1 мл 5%-го раствора сернокислой меди и доводят до кипения. Изменение цвета раствора и выпадение осадка красного цвета свидетельствуют о присутствии лактозы в растворе, которая обладает восстанавливающими свойствами и способна восстановить окись меди до закиси.
5. Определение кальция и фосфора в молоке
а) В пробирку приливают 2-3 мл фильтрата № 3, добавляют немного раствора молибденовокислого аммония и нагревают. Помутнение раствора свидетельствует о выпадении фосфорно-молибденово-кислого аммония. При охлаждении выпадает желтый кристаллический осадок (NH4)3PO4.12MoO3.
б) В пробирку вносят 2-3 мл фильтрата № 3, добавляют раствор щавелевокислого аммония – выпадает осадок щавелевокислого кальция.
6. Специфические реакции на кислое молоко
а) Реакция Уфельмана (на молочную кислоту)
Фильтрат кислого молока смешивают с реактивом Уфельмана (к 2-3 мл 2%-го раствора фенола прибавляют 4-5 капель раствора FeCl3), появляющееся желтое с зеленоватым оттенком окрашивание свидетельствует о наличии молочнокислого железа.
б) Алкогольная проба
В пробирку наливают 3-5 мл молока и такое же количество 68-70%-го спирта. Наклонив пробирку, наблюдают за происходящими изменениями. Свежее молоко слегка разжижается, так как в слабокислом молоке (около 22о Тернера) появляются отдельные зернышки а в сильнокислом (более 27о Тернера) – образуется много хлопьев.
Примечание. Градусом Тернера называют количество миллилитров 0,1 н раствора щелочи, необходимое для нейтрализации 100 мл молока.
в) Проба с кипячением
В пробирку наливают 3 мл молока и кипятят. Кислое молоко сворачивается. В качестве контроля проделывают такую же реакцию со свежим молоком и сравнивают результаты.
Общие выводы по работе:
ПРИЛОЖЕНИЯ
Сроки и условия хранения исследуемой пробы при определении некоторых показателей крови
При исследовании крови следует знать и учитывать целый ряд факторов, в противном случае возможна необъективная интерпретация полученных результатов.
Прежде всего, надо иметь в виду, что при наличии гемолиза некоторые биохимические показатели остаются без изменений, в то же время другие могут значительно отличаться от тех же показателей в негемолизированной сыворотке. В частности, гемолиз мешает определению концентрации общего белка, билирубина, холестерина, железа, мочевины, меди, неорганического фосфора, однако не оказывает существенного влияния на такие показатели, как активность холинэстеразы, концентрация глюкозы.
На некоторые показатели оказывает влияние присутствие антикоагулянтов. Так, стабилизация крови гепарином, цитратом или оксалатом мешает определению меди. В то же время присутствие антикоагулянтов не влияет на определение неорганического фосфора.
Наиболее важное значение имеют продолжительность хранения исследуемой пробы (с момента взятия крови и начала анализа) и условия, при которых она хранится. Концентрация неорганического фосфора остается стабильной в течение 7 суток при хранении при +4 оС и 2 суток – при комнатной температуре. С увеличением продолжительности срока хранения сыворотки содержание неорганического фосфора возрастает за счет распада органических веществ, содержащих фосфор (АТФ, глюкозо-6-фосфат и др.). Определение билирубина должно проводиться по возможности быстро, сыворотку нужно хранить в темном месте. Концентрация кальция в сыворотке крови не меняется в течение 10 дней как при +4 оС, так и при 20-25 оС. Концентрация холестерина достаточно стабильна в течение 6 суток при любых условиях хранения сыворотки крови. За такой же период (6 суток) не происходит серьезных изменений в содержании общего белка, однако в этом случае сыворотку необходимо хранить при температуре +4 оС. Концентрация меди и магния остается без изменений на протяжении 14 и 7 суток (соответственно). Концентрация железа в сыворотке крови не меняется в течение 7 суток, если ее хранить при +4 оС, и 4 суток – при хранении в условиях комнатной температуры. Активность холинэстеразы устойчива в сыворотке крови на протяжении 7 суток.
Определение концентрации глюкозы должно проводиться в течение 4 часов с момента взятия крови, так как при более длительном хранении содержание сахара снижается. При удалении белка концентрация глюкозы в надосадочной жидкости достаточно стабильна в течение 2-3 суток. Очень лабильна концентрация промежуточного метаболита глюкозы – пирувата. Для определения этого показателя кровь необходимо брать в охлажденные пробирки, не следует использовать жгут, а анализ проводят сразу же после взятия пробы.
Таблица перевода основных биохимических
показателей в систему СИ
| Показатели | Единицы СИ | Коэффициент перевода в систему СИ |
| Глюкоза Общий белок Билирубин Холестерин Кальций Фосфор Железо Медь Магний Каротин Витамин А Кетоновые тела ПВК | ммоль/л г/л мкмоль/л ммоль/л ммоль/л ммоль/л мкмоль/л мкмоль/л ммоль/л мкмоль/л мкмоль/л г/л мкмоль/л | мг% ´ 0,0555 г% ´ 10 мг% ´ 17,104 мг% ´ 0,0259 мг% ´ 0,2495 мг% ´ 0,3229 мкг% ´ 0,1791 мкг% ´ 0,1574 мг% ´ 0,4113 мкг% ´ 0,0186 мкг% ´ 0,0349 мг% ´ 0,01 мг% ´ 113,6 |
Вопросы к экзаменационным билетам
по биологической химии
1. Роль биохимии в развитии науки, промышленности и сельском хозяйстве.
БЕЛКИ. АМИНОКИСЛОТЫ
2. Классификация аминокислот.
3. Заменимые и незаменимые аминокислоты.
4. Моноаминодикарбоновые кислоты. Роль глютаминовой кислоты в обмене веществ.
5. Гетероциклические аминокислоты. Структура и биологическая роль гистидина.
6. Серосодержащие аминокислоты. Роль метионина и цистеина в обмене веществ.
7. Роль белков в организме животных.
8. Классификация белков.
9. Первичная структура белковой молекулы.
10. Вторичная структура молекулы белка.
11. Коллаген. Особенности его структуры, роль в организме.
12. Третичная структура белка.
13. Четвертичная структура белка. Примеры строения и функционирования олигомерных белков.
ФЕРМЕНТЫ
14. Химическая природа ферментов, их структура. Понятие об изоферментах и мультиэнзимных комплексах. Активный центр ферментов. Общее представление о механизме действия ферментов.
15. Активный центр ферментов.
16. Общие свойства ферментов.
17. Действие ингибиторов на активность ферментов. Типы ингибирования.
18. Специфичность действия ферментов.
19. Классификация и номенклатура ферментов.
20. Применение ферментов в научных исследованиях, в медицинской, ветеринарной и с/х практике.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
21. Структура и биологическая роль мононуклеотидов.
22. Структура, биологическая роль и пути биосинтеза АТФ в клетке.
23. Первичная структура нуклеиновых кислот.
24. Структура, свойства и функции основных классов РНК.
25. Особенности структуры и роль тРНК.
26. Структура и биологическая роль мРНК.
27. Рибосомы, их строение и роль в биосинтезе белка.
28. Структура и биологическая роль ДНК. Укладка ДНК в хроматине и в хромосомах.
29. Принцип комплементарности азотистых оснований в нуклеиновых кислотах, его роль.
30. Генетический код, его свойства.