И коллоидная химия (стр. 2 из 17)
3. Проверить, выключен ли микроамперметр (рукоятки 5 и 6 должны быть повернуты до отказа влево).
4. Прибор включить (вилку – в сеть; тумблер, расположенный на задней стенке в нижнем левом углу, переключить в положение «вкл»). При этом загорается лампочка накаливания.
5. Прибор прогреть в течение 15-20 минут.
II. Измерение оптической плотности раствора
1. Кювету с контролем или растворителем поставить в дальнее (от исследователя) гнездо кюветодержателя; кювету с исследуемым раствором (опыт) – в ближнее гнездо кюветодержателя.
2. Кювету с контролем (или растворителем) поместить в световой поток поворотом ручки 2 до отказа влево.
3. Закрыть крышку кюветного отделения (7).
4. Установить стрелку микроамперметра на 0 по нижней шкале поворотом ручки 5 («грубой» настройки). В случае необходимости воспользоваться ручкой 6 («точной» настройки).
Примечание. Если не удается вывести стрелку микроамперметра на 0, то необходимо повысить чувствительность фотоэлемента. Для этого необходимо:
а) микроамперметр выключить (рукоятки 5 и 6 до отказа влево);
б) рукоятку переключения чувствительности фотоэлемента (3) поставить на цифру 2 соответствующего цвета;
в) вывести стрелку микроамперметра на 0 по нижней шкале (то есть повторить действия, указанные в пункте 4).
Если и в этом случае стрелка микроамперметра не выводится на 0, необходимо еще раз повысить чувствительность фотоэлемента, повторяя все действия, перечисленные в пунктах «а», «б» и «в», но установив рукоятку 3 на цифру 3 соответствующего цвета.
5. Заменить в световом потоке кювету с контролем на кювету с исследуемым раствором (опытом), поворачивая рукоятку 2 до отказа вправо.
6. Записать величину оптической плотности исследуемого раствора по нижней шкале микроамперметра.
7. Микроамперметр выключить (рукоятки 5 и 6 до отказа влево).
III. Завершение работы на приборе
1. Реактивы из кювет вылить.
2. Кюветы сполоснуть дистиллированной водой и поставить в чашку Петри вверх донышком (кюветы необходимо полоскать только после полного завершения работы или методики, в промежутках между отдельными измерениями этого делать не следует !).
3. Прибор выключить (тумблер, расположенный на задней стенке в левом углу, переключить в положение «выкл.»; вилку вынуть из розетки).
4. Крышку кюветного отделения закрыть.
Примечание. При работе на КФК-2 необходимо соблюдать следующие правила:
1. До включения прибора в сеть проверить заземление.
2. Не оставлять прибор включенным без надобности.
3. Следить за чистотой прибора, не проливать реактивы.
4. Не хлопать крышкой кюветного отделения.
5. Особенно осторожно обращаться с кюветами, не царапать, протирать только мягкой и чистой тряпочкой (марлей).
6. При смене светофильтра работу продолжать не ранее чем через 5 минут.
7. При переключении светофильтров и замене кювет в кюветодержателе микроамперметр должен быть выключен (рукоятки 5 и 6 должны находиться в крайнем левом положении!).
6. Определение концентрации вещества в растворе
по оптической плотности
Определение концентрации вещества в окрашенном растворе по оптической плотности можно осуществить двумя способами – путем сравнения с оптической плотностью стандартного раствора (такой способ используется, например, в ортотолуидиновом методе определения глюкозы в крови) или, более точно, в результате построения калибровочной кривой. В этом случае готовят ряд растворов определяемого вещества с известными концентрациями (стандартные растворы), проделывают с ними необходимые химические реакции и измеряют на ФЭКе их оптическую плотность. Полученные результаты отражают графически, откладывая по оси абсцисс концентрацию вещества, а по оси ординат – соответствующую ей оптическую плотность. Определив оптическую плотность исследуемого раствора, находят по калибровочной кривой содержание в нем вещества.
Результаты проведенных исследований оформляют в виде таблицы:
| Длина волны | Цвет светофильтра | Е голубого раствора | Е желтого раствора |
Выводы:
РАЗДЕЛ 2. состав И СВОЙСТВА БЕЛКОВ
2. 1. АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКОВ
Анализ аминокислотного состава белков можно осуществлять несколькими способами. Присутствие тех или иных аминокислот может быть выявлено с помощью цветных реакций на белок, а также в результате кислотного его гидролиза и последующего разделения полученной смеси аминокислот методом хроматографии.
РАБОТА 2. ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ
Цель работы: ознакомиться с основными наиболее распространенными цветными реакциями на белки и доказать, что с их помощью можно выявить сходство и различия в аминокислотном составе исследуемых белков (яичный альбумин и желатин).
Задачи:
· провести цветные реакции на белки с раствором яичного альбумина и желатина;
· показать, что существуют универсальные цветные реакции, которые дают все белки, независимо от их аминокислотного состава, и специфические цветные реакции на определенные аминокислоты, позволяющие выявить различия в исследуемых белках;
· сравнить результаты проведенных исследований и сделать выводы;
· отметить, какие из проведенных реакций являются универсальными, а какие – специфическими.
Цветные реакции на белки являются качественными реакциями, обусловленными наличием специфических групп. Некоторые из таких реакций широко используются в биохимической практике для изучения структуры и аминокислотного состава белков, их количественного определения.
1. Биуретовая реакция (на обнаружение
пептидных связей в белках)
Принцип метода. Белки (пептиды) в щелочном растворе в присутствии солей меди (II) образуют комплексные ее соединения, окрашенные в сине-фиолетовый или красно-фиолетовый цвет.
Для пептидной (амидной) группы характерна лактам-лактимная таутомерия:
В щелочной среде преобладающая лактимная (енольная) форма полипептида взаимодействует с гидроксидом меди(II) с образованием стабильного окрашенного комплекса:
Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора белка (желатина, яичного белка или сывороточного альбумина) добавляют 1 мл 10%-го раствора щелочи (NaOH или KOH) и 1 каплю 1%-го раствора сульфата меди. Появляется сине-фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание.
2. Нингидриновая реакция (на аминогруппу,
находящуюся в a-положении)
Принцип метода. Белки, полипептиды и свободные a-амино-кислоты при нагревании реагируют с нингидрином с образованием продукта конденсации, окрашенного в фиолетовый цвет:
Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора белка прибавляют 0,5 мл 0,5%-го раствора нингидрина и нагревают до кипения. Появляется фиолетово-синее окрашивание.
Проделывают эту реакцию с раствором аминокислоты, взяв вместо раствора белка 1%-й раствор глицина. Сравнить полученные результаты и сделать вывод.
3. Реакция Сакагучи (на аргинин)
Принцип метода. Белки, содержащие аргинин, в присутствии щелочи дают красное окрашивание с гипобромитом и a-нафтолом. Гуанидиновая группа аргинина окисляется гипобромитом, и окисленный аргинин при взаимодействии с a-нафтолом образует продукт конденсации красного цвета:
Ход работы. К 0,5 мл 1%-го раствора белка (яичного белка, желатина) добавляют 0,5 мл 10%-го раствора щелочи, 3 капли 0,1%-го спиртового раствора a-нафтола и после перемешивания – 2-3 капли 2%-го раствора гипобромита натрия (NaBrO). Появляется красное окрашивание.
4. Реакция Фоля (на цистеин и цистин)
Принцип метода. При кипячении белка со щелочью от цистеина (цистина) легко отщепляется сера в виде сероводорода, который в щелочной среде образует сульфид натрия:
Для выявления сульфида натрия используют ацетат свинца, который при взаимодействии с избытком гидроксида натрия превращается в тетрагидроксоплюмбат:
Pb(CH3COO)2 + 4NaOH ® Na2[Pb(OH)4]+ 2CH3COONa
В результате взаимодействий ионов серы и свинца образуется сульфид свинца черного или бурого цвета:
Na2S + Na2[Pb(OH)4] ® PbS¯ + 4NaOH
Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора яичного белка или кусочку шерстяной нити добавляют 1 мл 30%-й щелочи и 3-4 капли 5%-го раствора ацетата свинца. При интенсивном кипячении жидкость окрашивается в бурый или черный цвет.
Реакцию Фоля проделывают с 1%-м раствором желатина, сравнивают полученные результаты и делают вывод.
5. Ксантопротеиновая реакция (на ароматические аминокислоты)
Принцип метода. При нагревании с концентрированной азотной кислотой белки дают желтое окрашивание. Реакция обусловлена наличием в белках ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина и триптофана) и основана на образовании нитропроизводных этих аминокислот, имеющих желтую окраску:
