И коллоидная химия (стр. 8 из 17)
б) Цветная реакция с ортотолуидиновым реактивом. В обычные сухие пробирки вносят по 0,5 мл надосадочной жидкости из каждой центрифужной пробирки, добавляют по 4,5 мл ортотолуидинового реактива и помещают в кипящую водяную баню (100 оС) на 8 минут. (Время инкубации проб и температурный режим необходимо соблюдать точно, кроме того, обязательным условием для нормального протекания данной реакции является непрерывное кипение воды в бане!). По истечении времени пробирки вынимают и охлаждают в водопроводной воде до комнатной температуры.
в) Измерение оптической плотности растворов. Оптическую плотность проб измеряют на фотоэлектроколориметре в кюветах на 10 мм против воды с красным светофильтром (620 нм)
Расчет. Содержание глюкозы в опытной пробе рассчитывают по стандартному раствору глюкозы по формуле:
С оп = (С ст. р-ра глюкозы ´ Е оп) / Е ст. р-ра глюкозы ,
где Cоп – концентрация глюкозы в крови в пробе, ммоль/л,
C ст. р-ра глюкозы. – концентрация глюкозы в стандартной пробе, 100 мг%,
Е оп. – оптическая плотность исследуемой пробы,
Е ст. р-ра глюкозы – оптическая плотность стандартного раствора глюкозы.
Примечание. Для перевода показателя в единицы СИ (ммоль/л) полученный результат при расчете необходимо умножить на 0,0555.
Нормальное содержание глюкозы в сыворотке крови человека, определенное этим методом, колеблется в пределах 3,33-5,55 ммоль/л (или 60-90 мг%).
Общие выводы по работе:
Работа 11. Глюкозооксидазный метод определения глюкозы в биологических жидкостях
Цель работы: ознакомиться с современным энзиматическим методом количественного определения глюкозы в биологических жидкостях, который широко применяется в клинической практике
Задачи:
· определить содержание глюкозы в предлагаемых образцах;
· проанализировать полученные результаты и сделать вывод.
Принцип метода. Глюкозооксидаза катализирует окисление глюкозы кислородом воздуха с образованием эквимолярного количества пероксида водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет фенол, который превращается в бензохинон, окрашенный в розовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации глюкозы в пробе.
Из набора реагентов OLVEX DIAGNOSTICUM готовят перед анализом:
Состав набора
1. Стандартный раствор глюкозы – 10 ммоль/л
2. Рабочий реагент содержащий:
а) фосфат-фенольный буфер (рН 7,5),
б) глюкозооксидазу (25 000 U/л),
в) пероксидазу (1500 U/л).
Ход работы
В три обычные химические пробирки наливают:
1) в опытную – 0,01 мл сыворотки крови или свежей мочи,
2) в стандартную – 0,01 мл стандартного раствора глюкозы,
3) в контрольную – 0,01 мл дист. Н2О.
Затем во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента, смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 10 минут при 37 оС. После окончания инкубации измеряют оптическую плотность опытной и стандартной пробы против контроля в кюветах на 5 мм (или 3 мм) при длине волны 490-510 нм.
Окраска стабильна в течение часа после окончания инкубации при условии отсутствия воздействия прямых солнечных лучей.
Примечание
Количество глюкозы в моче определяют только при положительной качественной реакции на глюкозу. Реакция считается положительной, если смесь из 0,01 мл исследуемой мочи и 0,5 мл рабочего реагента через 15 минут приобретает розовую окраску.
Расчет
Расчет концентрации глюкозы проводят по формуле:
С = Е0/ Ест. ´10,
где Е0 – оптическая плотность опыта,
Ест. – оптическая плотностьстандарта,
10 – концентрация стандартного раствора глюкозы в моль/л.
Нормальное содержание глюкозы, определенное этим методом
в сыворотке или плазме крови здорового человека составляет 4,2-6,1 ммоль/л, в моче – < 0,8 ммоль/л.
Результаты:
Общие выводы по работе:
Вопросы для тестового контроля
1. Что такое углеводы?
2. Что такое моносахариды? Приведите примеры.
3. Что такое дисахариды? Приведите примеры.
4. Что такое полисахариды? Приведите примеры.
5. Назовите компоненты мальтозы. Напишите структурную формулу мальтозы. В чем ее отличие от изомальтозы?
6. Назовите компоненты лактозы. Напишите ее структурную формулу.
7. Структура и биологическая роль крахмала.
8. В чем различие между крахмалом и целлюлозой?
9. Какова суточная потребность в углеводах у человека?
10. Как происходит переваривание крахмала в организмах человека и моногастричных животных?
11. Какова роль балластных веществ? Происходит ли гидролиз целлюлозы в желудочно-кишечном тракте моногастричных животных?
12. В чем отличие переваривания углеводов у жвачных животных?
13. Какие существуют пути утилизации глюкозы в клетке?
14. Что такое гликолиз?
15. Какие ферменты в гликолизе являются ключевыми?
16. Какое значение имеет гликолиз?
17. В чем сходство и различие между гликолизом, гликогенолизом, спиртовым брожением и молочно-кислым брожением?
18. В чем различие между аэробным и анаэробным распадом глюкозы в клетке?
19. Что такое окислительное декарбоксилирование ПВК? Назовите основные компоненты мультиэнзимного комплекса, катализирующего этот процесс, и напишите общее уравнение этих реакций.
20. Какова роль ЦТК?
21. Назовите два основных пути синтеза глюкозы в организме.
22. Каково биологическое значение пентозофосфатного пути?
23. Какие 2 фазы выделяют в пентозофосфатном пути?
24. В чем сходство и различие между гликолизом и глюконеогенезом?
25. Почему глюконеогенез особенно важен для животных с четырехкамерным желудком?
26. Какие факторы способствуют усилению и ослаблению глюконеогенеза?
27. Какие ферменты участвуют в синтезе гликогена?
28. Какие ферменты участвуют в распаде гликогена в клетке?
29. Какой гликоген является источником глюкозы в крови?
30. Что такое цикл Кори? Каково его значение?
31. Какова концентрация глюкозы в крови человека? Причины гипо- и гипергликемии?
32. Почему не эффективен прием инсулина через рот?
33. Что такое почечная гликозурия? Когда она возникает?
34. Какая существует разница состава мочи у голодающих и
больных сахарным диабетом?
Задачи
1. Какой общий метаболит образуется из аминокислот, глюкозы и жирных кислот?
2. Какой из перечисленных ферментов катализирует реакцию биосинтеза гликогена:
а) a-1,6-глюкозидаза, б) гликогенфосфорилаза,
в) гликоген-синтетаза, г) фосфоглюкомутаза?
3. Сколько молекул восстановительных эквивалентов образуется в ЦТК?
Какие превращения в ЦТК связаны с гидратацией субстрата:
а) цитрата в цис-аконитат; б) сукцинил-КоА в сукцинат; в) фумарата в малат; г) оксалоацетата в сукцинат; д) цис-аконитата в изоцитрат?
5. На каких этапах превращения цикла Кребса происходят реакции дегидрирования:
а) цитрата в цис-аконитат; б) цитрата в изоцитрат; в) окислительное декарбоксилирование a-кетоглутарата; г) малата в оксалоацетат; д) сукцината в фумарат; е) фумарата в малат; ж) изоцитрата в a-кетоглутарат?
6. Напишите уравнения реакций пентозофосфатного цикла, связанные с образованием НАДФН+Н+. Какие ферменты катализируют эти реакции?
7. Почему гиповитаминоз В1 приводит к накоплению концентрации пирувата в крови и органах?
8. Какие изменения в обмене углеводов возникают в результате полного голодания: а) в течение 1-2 суток; б) при более длительном периоде (до 7 суток).
9. Почему при анемии организм хуже переносит физические нагрузки?
10. Почему при гипоксии повышено содержание пирувата в крови?
11. Почему при недостаточной обеспеченности организма витаминами В1, В2 и В5 повышено содержание лактата и пирувата в крови и органах?
12. Почему для повышения качества мяса перед транспортировкой животных к месту забоя рекомендуют применять транквилизаторы (мебикар и др.)?
13. Укажите, какие изменения в метаболизме углеводов возникают при приеме алкоголя натощак:
а) уменьшается отношение НАД+/НАДH+Н+?
б) увеличивается концентрация лактата и уменьшается
концентрация пирувата в печени и крови?
в) уменьшается скорость глюконеогенеза в печени?
г) ускоряется синтез гликогена в печени?
14. Почему во время обильной лактации у коров часто выявляют гипогликемию?
15. Почему при некоторых онкологических заболеваниях в крови повышено содержание лактата?
16. Почему при одновременном употреблении легко усваиваемых углеводов организм человека испытывает чувство голода?
17. Почему при недостаточном поступлении в организм тиамина (витамин В1) снижается эффективность кормового рациона и повышаются затраты кормов на единицу прироста?
18. Почему во время лактации потребности коров в углеводах возрастают?
19. Около 80% всей глюкозы, синтезируемой в организме овцы, используется в вымени. Расходуется глюкоза для образования молока, главным образом на синтез лактозы, триглицеридов молока. Зимой при низком качестве корма развивается кетоз. Обычно в таких случаях дают большие дозы пропионата. Почему?