И коллоидная химия (стр. 3 из 17)

Нитропроизводные аминокислот в щелочной среде образуют соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет:

Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора альбумина или яичного белка добавляют 5 капель концентрированной азотной кислоты. Появляется осадок. При осторожном нагревании смесь окрашивается в желтый цвет. После охлаждения осторожно добавляют 10 капель концентрированного раствора аммиака (или 30%-й раствор едкого натра), при этом желтая окраска переходит в оранжевую.

Проделывают эту реакцию с 1%-м раствором желатина и 0,1%-м раствором тирозина, сравнивают результаты и делают выводы.

6. Реакция Миллона (на тирозин)

Принцип метода. Реакция Миллона открывает в белке тирозин, в составе которого имеется фенольный радикал. При нагревании белка с реактивом Миллона (смесь нитратов и нитритов ртути (I) и (II), растворенных в концентрированной азотной кислоте) образуется осадок, окрашенный сначала в розовый, а затем в красный цвет. Реактив Миллона дает окрашивание почти со всеми фенолами:

Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора яичного белка добавляют 3-5 капель реактива Миллона и осторожно нагревают до образования окрашенного в красный цвет осадка.

Аналогично проделывают реакцию с растворами желатина, тирозина и фенола. Полученные результаты сравнивают и делают вывод.

7. Реакция Адамкевича (на триптофан)

Принцип метода. Белки, содержащие триптофан, в присутствии глиоксиловой и серной кислот дают красно-фиолетовое окрашивание. Реакция основана на способности триптофана взаимодействовать в кислой среде с альдегидами (глиоксиловой кислотой) с образованием окрашенных продуктов конденсации:

Глиоксилевая кислота всегда присутствует в небольшом количестве в ледяной уксусной кислоте, которую используют в реакции Адамкевича.

Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора белка добавляют 1 мл ледяной (концентрированной) уксусной кислоты и осторожно нагревают до растворения осадка. После охлаждения к смеси осторожно добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты (по каплям, по стенке пробирки, чтобы жидкости не смешались). Через 5-10 минут на границе раздела двух слоев наблюдают образование красно-фиолетового кольца.

Проделывают реакцию Адамкевича с 0,1%-м раствором триптофана, сравнивают полученные результаты и делают вывод.

8. Реакция Ваузене (на триптофан)

Принцип метода. Белки, содержащие триптофан, дают в кислой среде в присутствии нитрита натрия и формальдегида сине-фиолетовое окрашивание. В этой реакции триптофан взаимодействует с формальдегидом с образованием продукта конденсации (бис-2-триптофанил-метана), который окисляется нитритом натрия до бис-2-триптофанил-карбинола, который в присутствии минеральных кислот образует соли сине-фиолетового цвета.

Ход работы. К 2 мл 1%-го раствора яичного белка добавляют 1 каплю 2,5%-го раствора формальдегида. К полученной смеси, тщательно перемешивая, добавляют осторожно, по каплям 6 мл концентрированной серной кислоты, охлаждая пробирку в ванночке со льдом. Через 10 минут добавляют, перемешивая, 10 капель 0,5%-го раствора нитрита натрия. Появляется сине-фиолетовая окраска.

9. Реакция Паули (на гистидин и тирозин)

Принцип метода. Реакция Паули позволяет обнаружить в белке аминокислоты гистидин и тирозин, которые образуют с диазобензол-сульфоновой кислотой соединения вишнево-красного цвета. Диазобензолсульфоксилота кислота образуется в реакции диазотирования при взаимодействии сульфаниловой кислоты с нитритом натрия (или калия) в кислой среде:

Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора сульфаниловой кислоты (готовится на 5%-м растворе соляной кислоты) прибавляют 2 мл 0,5%-го раствора нитрита натрия, тщательно перемешивают, добавляют 2 мл 1%-го раствора яичного белка и после перемешивания - 6 мл 10%-го раствора карбоната натрия. После перемешивания смесь окрашивается в вишнево-красный цвет.

Проделывают эту реакцию с 0,1%-м раствором гистидина, сравнивают полученные результаты и делают вывод.

Общие выводы по работе:

РАБОТА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ИЗ ТКАНЕЙ

И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ.

ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА простых и сложных белков

Цель работы: ознакомиться с основными этапами изучения состава простых и сложных белков (гомогенизация биоматериала, экстракция белков, гидролиз и разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии, определение составных компонентов простетической группы).

Задачи:

· выделить белки из мышечной ткани и яичного альбумина;

· провести кислотный гидролиз яичного альбумина;

· разделить предложенную смесь аминокислот методом распределительной хроматографии, определить, какие аминокислоты входят в ее состав;

· с помощью качественных реакций определить основные компоненты простетической группы сложных белков (на примере нуклеопротеидов дрожжей).

Первый этап. Выделение белков из биоматериала

а) Выделение белков из мышечной ткани

Принцип метода. Миофибриллы мышечной клетки содержат сократительные белки (миозин и актин) и регуляторные белки (тропомиозин и тропонин). Белки миофибрилл не растворяются в воде, но их можно экстрагировать из мышечной ткани солевыми растворами с концентрацией соли 0,5 моль/л. Многие белки саркоплазмы (гиалоплазмы мышечных клеток) растворимы в воде или солевых растворах низкой концентрации (0,05 моль/л). При экстракции мышечной ткани 5%-м раствором хлорида калия извлекаются как миофибриллярные, так и саркоплазматические белки.

Ход работы

1. Взвешивают 2 г мышечной ткани. Измельченную ножницами навеску помещают в фарфоровую ступку, добавляют 2 мл 5%-го раствора хлорида калия и растирают со стеклянным песком до гомогенного состояния. К гомогенату добавляют 3 мл раствора хлорида калия и растирают кашицу в течение 5 минут, после чего прибавляют еще 5 мл 5%-го раствора хлорида калия и продолжают растирание в течение 5 минут.

2. Полученный гомогенат фильтруют через два слоя марли или центрифугируют в течение 15 минут при 4000 об/мин.

3. С фильтратом (или центрифугатом) проделывают цветные реакции на белки (биуретовую, ксантопротеиновую, реакцию Миллона, Фоля и Сакагучи).

б) Выделение яичного альбумина

Принцип метода. Яичный белок представляет собой смесь нескольких белков. Примерно 70% яичного белка составляет альбумин, который легко отделяется от глобулинов. При десятикратном разведении яичного белка дистиллированной водой глобулины выпадают в осадок, а альбумин остается в растворе.

Ход работы

1. Чтобы отделить белок от желтка, осторожно проделывают отверстия в скорлупе яйца с двух концов и выливают белок в стакан емкостью 500 мл, затем в стакан добавляют 250 мл дистиллированной воды и содержимое тщательно перемешивают стеклянной палочкой с резиновым наконечником.

2. Раствор переносят в мерный цилиндр и объем доводят дистиллированной водой до 300 мл. Раствор оставляют на 30 минут при комнатной температуре для образования хлопьевидного осадка глобулинов.

Примечание: работу, описанную в пунктах 1 и 2, выполняет и демонстрирует дежурный студент, приготовленную суспензию затем использует каждый студент в группе.

3. 20 мл полученной суспензии дважды фильтруют через склад-чатый фильтр.

4. С фильтратом, содержащим яичный альбумин, проделывают цветные реакции на белки (биуретовую, нингидриновую, ксантопротеиновую, реакции Миллона, Фоля).

Второй этап. Кислотный гидролиз белков

Принцип метода. В процессе гидролиза белков происходит разрыв пептидных связей и молекула белка распадается сначала на высокомолекулярные полипептиды, затем на более простые пептиды и, наконец, на аминокислоты. Кислотный гидролиз белков проводят в присутствии соляной или серной кислот при кипячении.

Гидролиз, проводимый в лабораторных условиях, является важным методом изучения первичной структуры белка. В организме гидролиз постоянно протекает в процессе пищеварения и в тканях под действием протеолитических ферментов.

Ход работы. В небольшую колбочку, снабженную обратным холодильником, наливают 2-3 мл 2%-го раствора альбумина и 15-20 мл 25%-го раствора серной кислоты. Содержимое колбы кипятят под тягой в течение 60-90 минут. Через каждые полчаса (с момента закипания) с гидролизатом проделывают биуретовую реакцию, для этого к 0,5 мл гидролизата добавляют 30%-й раствор щелочи до нейтральной реакции по универсальной индикаторной бумаге и 1-2 капли 1%-го раствора сульфата меди. Отрицательная биуретовая реакция указывает на полное расщепление белка до аминокислот.

Для сравнения биуретовую реакцию делают с 2%-м раствором альбумина.

Вывод (написать уравнение гидролиза белков):

Третий этап. Разделение смеси аминокислот методом

распределительной хроматографии на бумаге

Принцип метода. Метод основан на различной растворимости аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях: воде и органическом растворителе. Водная фаза неподвижна, так как вода сорбирована на инертном носителе – целлюлозе, которая в насыщенной влагой атмосфере (хроматографической камере) удерживает до 20-22% воды. Подвижной фазой является насыщенный водой органический растворитель. Чем больше растворимость аминокислот в воде и меньше в органическом растворителе, тем медленнее движется аминокислота на бумаге.