Осаждение белков неорганическими осадителями
Осаждение белков минеральными кислотами
Ход работы. В пробирку осторожно наливают около 1 мл концентрированной азотной кислоты. Затем, наклонив пробирку, медленно, по стенке добавляют 1 мл 1%-го раствора белка. На границе двух жидкостей появляется осадок в виде белого кольца.
Такую же реакцию проделывают с концентрированной соляной и серной кислотами.
Осаждение белков солями тяжелых металлов
Ход работы. В три пробирки наливают по 1 мл 1%-го раствора белка и добавляют по 3-4 капли: в первую пробирку – 7%-го раствора сульфата меди, во вторую – 5%-го раствора ацетата свинца, в третью – 5%-го раствора нитрата серебра. Во всех пробирках образуется осадок.
Осаждение белков органическими осадителями
Ход работы. В 2 пробирки наливают по 2 мл 1%-го раствора белка и добавляют: в одну пробирку 4-5 капель 10%-го раствора сульфосалициловой кислоты, в другую – 5-10 капель 10%-й трихлоруксусной кислоты (CCl3COOH). Выпадает осадок белка.
Осаждение белка органическими растворителями
Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора белка добавляют 2 мл органического растворителя (96%-го этанола, хлороформа, ацетона или эфира) и перемешивают. Образование осадка можно усилить добавлением нескольких капель насыщенного раствора хлорида натрия.
Осаждение белков реактивами на алкалоиды
Ход работы. В три пробирки наливают по 1 мл 1%-го раствора белка, по 4-5 капель 1%-го раствора уксусной кислоты и по 2-3 капли: в первую пробирку – 10%-го раствора пикриновой кислоты, во вторую – насыщенного раствора танина, в третью – 5%-го раствора железистосинеродистого калия. Наблюдают выпадение осадка.
Ход работы. В пять пробирок наливают по 0,5 мл 1%-го раствора яичного белка.
Содержимое первой пробирки нагревают до появления опалесценции (помутнения раствора).
К раствору белка во второй пробирке осторожно добавляют 1 каплю 1%-го раствора уксусной кислоты, нагревают и наблюдают вначале появление опалесценции, а затем выпадение белого хлопье-видного осадка белка. Это объясняется тем, что белок теряет заряд и находится в изоэлектрическом состоянии.
К раствору белка в третьей пробирке добавляют 1-2 капли 10%-го раствора уксусной кислоты и нагревают. Осадок не образуется, так как в кислой среде частицы белка перезаряжаются и приобретают положительный заряд.
К раствору белка в четвертой пробирке добавляют 1-2 капли 10%-го раствора уксусной кислоты, 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия и нагревают. Выпадает осадок вследствие адсорбции ионов электролита (образование двойного электрического слоя) и нейтрализации заряда на частицах белка.
К раствору белка в пятой пробирке добавляют 1 каплю 10%-го раствора гидроксида натрия и нагревают. Осадок не образуется, так как в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка усиливается.
Обратимое осаждение белков (высаливание)
При добавлении к водным растворам белков сульфатов или хлоридов щелочных и щелочно-земельных металлов (Na2SO4, NaCl, MgSO4 и др.) происходит дегидратация и нейтрализация белковых частиц, при этом белки выпадают в осадок без изменения нативной структуры. Такой тип осаждения белков называется высаливанием. Высаливание – обратимый процесс, и после удаления соли (разбавлением водой, диализом) белок вновь приобретает природные свойства. Поскольку разные белки высаливаются при различных концентрациях солей, этот метод используется для фракционирования белков. Для разделения белков методом высаливания широко применяется сульфат аммония.
Фракционное осаждение белков плазмы крови
сульфатом аммония
Принцип метода. Фибриноген выпадает в осадок при 33%-м насыщении плазмы сернокислым аммонием, глобулины – при полунасыщении, а альбумины – при полном насыщении.
Ход работы
К 2 мл плазмы крови (для измерения объемов жидкостей в данном опыте используют мерные пробирки) добавляют 5 мл дистиллированной воды, 3,5 мл насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. В осадок выпадает фибриноген (можно наблюдать лишь незначительное помутнение), который отделяют фильтрованием. Наличие белка на фильтре проверяют биуретовой реакцией: для этого воронку с фильтром переносят в чистую пробирку и на фильтр наливают 1 мл 10%-го раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1%-го раствора сульфата меди. Фильтрат (№ 1) используют для дальнейшей работы.
К 4 мл фильтрата № 1 добавляют 4 мл насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. В осадок выпадают глобулины, которые отделяют фильтрованием. Получают осадок, с которым проделывают биуретовую реакцию, и фильтрат № 2.
К фильтрату № 2 добавляют при постоянном перемешивании стеклянной палочкой кристаллический сульфат аммония до насыщения (пока соль не перестанет растворяться). Выпадают в осадок альбумины, наличие которых проверяют биуретовой реакцией: 1 мл смеси переносят в чистую пробирку, добавляют 1 мл 10%-го раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1%-го раствора сульфата меди.
Оставшийся фильтрат № 2 используют для доказательства обратимости процессов высаливания. Для этого в насыщенный раствор фильтрата № 2 добавляют дистиллированную воду до полного растворения осадка. Для сравнения такой же опыт проделывают с пробиркой, в которой белок был осажден трихлоруксусной кислотой (см. выше). Сравнивают результаты и делают выводы.
Общие выводы по работе:
Вопросы для тестового контроля
1. Что такое a-аминокислота? Приведите примеры.
2. Назовите серосодержащие аминокислоты. Напишите их формулы.
3. Какая аминокислота оптически неактивна? Напишите ее формулу.
4. Какие аминокислоты содержат ароматические кольца? Напишите их формулы.
5. Какие аминокислоты заряжаются отрицательно при рН=7? Напишите их формулы.
6. Какие аминокислоты заряжаются положительно при рН=7? Напишите их формулы.
7. Назовите гидроксилсодержащие аминокислоты. Напишите их формулы.
8. Назовите неполярные аминокислоты. Напишите их формулы.
9. Перечислите реакции, с помощью которых можно обнаружить аминокислоты. Укажите, на какие функциональные группы эти реакции?
10. Какова роль аминокислот?
11. Что такое белки?
12. Назовите универсальные реакции на белки.
13. Что открывает биуретовая реакция?
14. Что такое полноценные белки?
15. Какие аминокислоты называют незаменимыми? Назовите их.
16. Какие аминокислоты относят к условно незаменимым? Назовите их.
17. Каково содержание азота в белках?
18. Какое число используется для перевода азота в белок?
19. Какие существуют уровни белковой структуры?
20. Что такое первичная структура?
21. Что такое вторичная структура? Назовите типы вторичной структуры.
22. Укажите основные характеристики a-спирали.
23. Назовите формы b-структуры. Укажите основные ее характеристики.
24. Что такое простые белки?
25. Что такое сложные белки?
26. Что такое фибриллярные белки? Приведите примеры фибриллярных белков.
27. Какие белки называются глобулярными?
28. Какова особенность структуры коллагена и чем она обусловлена?
29. Какова особенность кератиновых белков и чем она обусловлена?
РАЗДЕЛ 3. ФЕРМЕНТЫ
РАБОТА 5. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ДЕЙСТВИЕМ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ
Цель работы: ознакомиться с каталитическим действием некоторых ферментов пищеварительного тракта (амилазы слюны, пепсина и липазы) и каталазы крови.
Задание:
· проделать предложенные реакции;
· написать уравнения реакций, катализируемых исследуемыми ферментами;
· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.
1. Амилаза слюны
Амилаза слюны осуществляет гидролиз крахмала или гликогена.
Ход работы. В две пробирки вносят по 5 мл 0,2 %-го раствора крахмала, в одну из них добавляют 0,5 мл слюны. Содержимое перемешивают и пробы помещают в водяную баню (37 оС) на 15 минут.
В обе пробирки добавляют по 5 капель раствора Люголя (йода). В пробирке со слюной (амилазой) раствор не дает реакции на полисахарид, а в пробирке без слюны образуется сине-фиолетовое окрашивание.
2. Липаза поджелудочной железы
Липаза гидролизует жиры на глицерин и жирные кислоты, количество которых можно определить титрованием щелочью.
Ход работы. В две пробирки вносят по 1 мл растительного масла, 4 мл дистиллированной Н2О, 5 мл 1%-го раствора NaHCO3. Содержимое энергично встряхивают до образования эмульсии. Затем в обе пробирки добавляют по 5 капель спиртового раствора фенолфталеина, в одну из пробирок (опыт) – 1 мл липазы, а в другую (контроль) – 1 мл Н2О. Содержимое тщательно перемешивают и ставят в термостат (37 оС) на 15-20 минут. Вследствие образования жирных кислот в ходе реакции и нейтрализации ими щелочной среды раствор в пробе с липазой становится менее окрашенным или обесцвечивается, а в пробе без липазы не изменяется.
3. Пепсин
Пепсин, фермент желудочного сока, гидролизует белки до пептидов и аминокислот.
Ход работы. В две пробирки вносят несколько миллилитров раствора белка (альбумина) и легким подогревом на спиртовке или электроплитке денатурируют его. Пробы охлаждают до комнатной температуры и в одну из них добавляют раствор пепсина, а в другую – 1 мл Н2О. Обе пробы помещают в термостат (37 оС) на 20 минут, после чего сравнивают результаты.