И коллоидная химия (стр. 6 из 17)
4. Каталаза
Каталаза инактивирует перекись водорода, разлагая ее на воду и молекулярный кислород:
2Н2О2 ® 2Н2О + О2
Этот фермент содержится в эритроцитах, в клетках печени и других тканей.
Ход работы. В две пробирки вносят по 2 мл свежеприготовленного 5%-го раствора перекиси водорода, в одну из проб добавляют 1 каплю крови и перемешивают. В пробе с кровью (каталазой) вследствие выделения кислорода наблюдается интенсивное образование пузырьков.
Общие выводы по работе:
РАБОТА 6. ЗАВИСИМОСТЬ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ И рН СРЕДЫ
Цель работы: на примере амилазы слюны ознакомиться
с некоторыми специфическими свойствами ферментов.
Задание:
· проделать необходимые реакции;
· проанализировать полученные результаты и сформулировать выводы;
· написать уравнения реакций каталитического расщепления крахмала амилазой слюны.
Каждый фермент имеет свой оптимум рН, температуры и наибольшее сродство к какому-то субстрату. В этих условиях активность фермента максимальна.
1. Влияние температуры на активность амилазы
Ход работы. В три пробирки вносят по 1 мл слюны, одну из них помещают в лед, другую – в термостат с температурой 37 оС, содержимое третьей кипятят 5 минут, охлаждают струей воды и тоже помещают в термостат. Через 5 минут после этого во все пробы добавляют 5 мл 0,2%-го раствора крахмала, перемешивают и помещают в прежние условия. Через 20 минут во все пробы добавляют по 5 капель раствора Люголя.
Сравните окраску раствора всех проб и объясните различия.
2. Специфичность действия амилазы
Ход работы. В две пробирки вносят по 1 мл слюны. В одну из них добавляют 5 мл 0,2%-го раствора крахмала, в другую – 5 мл 0,5%-го раствора сахарозы. Пробы помещают на 20 минут в термостат (37 оС), после чего добавляют в них по 1 мл 10%-го раствора NaOH и по 0,5 мл 5%-го раствора сернокислой меди и содержимое доводят до кипения. В пробирке с крахмалом под влиянием амилазы образуется мальтоза, способная восстановить окись меди до закиси (красного цвета), – положительная проба Троммера. На сахарозу амилаза не действует, и в этой пробе окись меди не восстанавливается.
3. Определение оптимума рН активности амилазы
Ход работы. Перед началом работы готовят раствор амилазы. Для этого смешивают 1 мл 1%-го раствора крахмала и 0,5 мл слюны, разбавленной в 10 раз. Через каждые 2 минуты отбирают на предметное стекло по 1 капле этой смеси и добавляют к ней 1 каплю раствора Люголя. Крахмал должен полностью расщепиться за 10 минут (желтая окраска пробы с йодом). Если расщепление крахмала происходит быстрее, слюну надо развести еще в 2-4 раза; если медленнее – уменьшить начальное разведение.
В восемь пронумерованных пробирок наливают по 2 мл фосфатного буфера соответственно с рН: 5,4; 5,8; 6,2; 6,6; 6,8; 7,0; 7,4; 8,0. Во все пробирки добавляют по 5 мл 0,2%-го раствора крахмала (приготовленного на 0,1%-м растворе NаС1) и по 1 мл разбавленной слюны. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают стеклянной палочкой, после чего пробирки помещают в термостат при 37 оС. Через каждые 3 минуты 1 каплю жидкости, взятой из пятой пробирки, смешивают на предметном стекле с 1 каплей раствора Люголя. Вначале при смешивании образуется синее окрашивание, затем фиолетовое, фиолетово-красное. Как только проба из пятой пробирки даст с йодом на предметном стекле красно-бурое окрашивание, все пробирки извлекают из термостата, охлаждают под струей холодной воды и добавляют по 2 капли раствора Люголя. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и сравнивают окрашивание.
Общие выводы по работе:
РАБОТА 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИНОТРАНСФЕРАЗ
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПО МЕТОДУ КИНГА
Цель работы: ознакомиться с одним из методов определения активности аминотрансфераз, широко используемых в медицинской и сельскохозяйственной практике для выявления заболеваний и прогнозирования хозяйственно полезных признаков у животных.
Задание:
· ознакомиться с предложенным методом определения активности аминотрансфераз в сыворотке крови;
· провести анализ и сделать выводы.
Определение активности аминотрансфераз (трансаминаз) крови имеет большое диагностическое значение. Например, при инфаркте миокарда в крови увеличена активность аспартатаминотрансферазы, при инфекционном гепатите возрастает активность аланинамино-трансферазы.
Принцип метода. Метод Кинга основан на способности аланин- и аспартаттрансаминаз конденсировать 2,4-динитрофенилгидразин и продукты дезаминирования аминокислот – пировиноградную и щавелевоуксусную кислоты:
Ход работы. В одну пробирку вносят 0,2 мл сыворотки крови (опытная проба), в другую – 0,2 мл дистиллированной воды (контрольная проба); в обе пробирки добавляют по 0,5 мл 2%-го раствора аспарагиновой кислоты и по 0,5 мл 0,6%-го раствора a-кетоглутаровой кислоты. Пробы перемешивают и помещают на 60 минут в термостат (37 оС), после чего каталитическое действие фермента останавливают добавлением в обе пробы по 1 мл 0,1%-го раствора 2,4-динитрофенилгидразина и вновь помещают в термостат на 15 минут. Затем добавляют по 10 мл 0,4 н раствора NaOH и оставляют на 1-2 минуты до появления окраски. Пробы колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофильтром в кюветах с толщиной слоя 10 мм.
Активность аминотрансфераз выражают в условных единицах, умножая оптическую плотность на 100.
У здоровых людей активность аминотрансфераз в сыворотке крови составляет 10-35 единиц.
Результаты:
Общие выводы по работе:
Вопросы для тестового контроля
1. Что такое ферменты?
2. Какова природа ферментов?
3. Что такое константа Михаэлиса (КМ)? В каких единицах она определяется?
4. Какие факторы влияют на ферментативную активность?
5. Что такое специфичность фермента? Назовите виды специфичности.
6. Что такое активный центр фермента?
7. Какую модель взаимодействия фермента и субстрата предложил Фишер?
8. Что такое модель индуцированного соответствия?
9. В чем различие между простетической группой и коферментом?
10. Что понимают под активностью фермента?
11. Что такое ингибиторы?
12. Назовите типы ингибирования.
13. Каков механизм специфического необратимого ингибирования? Приведите примеры.
14. Каков механизм неспецифического необратимого ингибирования? Приведите примеры.
15. Что такое конкурентное ингибирование? Приведите примеры.
16. Каков механизм аллостерического ингибирования? Какова его роль? Приведите примеры.
17. Что такое активаторы? Как ионы металлов активируют фермент?
18. Какова роль ионов металлов в катализе?
19. Какими способами регулируется активность ферментов?
20. Что такое конститутивные и индуцируемые ферменты?
21. Что такое компартментализация ферментов?
22. Что такое изоферменты? Приведите примеры.
23. На чем основана классификация ферментов?
24. Как используются ферменты в медицине, сельском хозяйстве и научных исследованиях? Приведите примеры.
РАЗДЕЛ 4. ВИТАМИНЫ
РАБОТА 8. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА НЕКОТОРЫЕ ВИТАМИНЫ
Цель работы: ознакомиться со свойствами и особенностями структуры некоторых витаминов.
Задачи:
· проделать предложенные химические реакции;
· проанализировать полученные результаты и сделать вывод.
1. Диазореакция на тиамин (В1)
Принцип метода. Раствор тиамина при добавлении к нему диазобензолсульфокислоты и щелочи окрашивается в оранжевый или красный цвет, вследствие образования соединения тиамина с диазобензолсульфокислотой.
Ход работы. К 5 каплям 1%-го раствора сульфаниловой кислоты прибавляют 5 капель 5%-го раствора азотистокислого натрия, образуется диазобензолсульфокислота. К диазобензолсульфокислоте прибавляют немного порошка тиамина (или раствора), 5-7 капель 10%-го раствора карбоната натрия (соды). Жидкость окрашивается в оранжевый или красный цвет. Если раствор соды осторожно приливать по стенке наклоненной пробирки, то на границе двух жидкостей образуется красное кольцо.
2. Реакция окисления тиамина в тиохром
Принцип метода. При действии железосинеродистого калия тиамин окисляется с образованием желтого пигмента тиохрома.
Ход работы. К 1 капле раствора тиамина прибавляют 5-10 капель 10%-го раствора едкого натра и 1-2 капли 5%-го раствора железосинеродистого калия и перемешивают. При нагревании жидкость окрашивается в желтый цвет в результате превращения тиамина в тиохром.
3. Реакция восстановления рибофлавина (В2)
Ход работы. В пробирку наливают 10 капель взвеси рибофлавина в воде, добавляют 5 капель концентрированной соляной кислоты и опускают кусочек металлического цинка. Начинается бурное выделение пузырьков водорода и жидкость постепенно окрашивается в розовый или красный цвет, затем окраска жидкости начинает бледнеть и обесцвечиваться.
4. Проба на никотиновую кислоту (РР или В5)
Принцип метода. При нагревании никотиновой кислоты с уксуснокислой медью образуется осадок медной соли никотиновой кислоты.
